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自1981年HIV-1被首次发现，并于1984年确定为获得性免疫缺陷综合症的病原体以来，艾滋病已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。真正控制乃至消除艾滋病的理想途径是有效疫苗的研发和应用。目前大多数成功疫苗都是通过诱导有效的中和抗体来保护机体免受感染的，例如乙肝（HBV）疫苗、人乳头瘤病毒（HPV）疫苗、流感疫苗等[1]。HIV的膜蛋白(Env)位于病毒颗粒表面，是中和抗体的唯一作用靶位。然而，由于HIV膜蛋白基因的易变性和低免疫原性，迄今为止还没有疫苗能在体内诱导有效中和抗体。在HIV自然感染过程中，15％～25%的患者可以产生广谱中和抗体，虽然这类抗体不能清除患者体内的病毒，但能在体外中和目前已分离的大部分病毒株。对于HIV患者体内该类抗体产生过程和机制的研究，将会对HIV疫苗设计，特别是基于中和抗体的疫苗设计有很好的指导意义。 本课题首先用假病毒中和试验对 HIV患者血浆样本进行检测，检测样本为来自我国北京的HIV-1阳性的MSM人群，共75份，包括我国流行的三个主要亚型：B’、BC和AE亚型，感染时间一年半以上，血浆检测所用假病毒为：SC19-15（BC亚型）、S91-2（AE亚型）、SF162（B亚型）和 M1-27（B’亚型），并以 VSV假病毒作为对照，排除血浆的非特异反应。基于中和至少两种类型的假病毒，AE亚型血浆的中和活性最高，达53%（20/38）；BC亚型和B’亚型血浆分别占27%（3/11）和23%（6/26）。从中，我们选择了9份中和效力和中和广谱性较好的HIV AE亚型患者样本：YA141（B）、YA155（C）、YA165（D）、YA086（E）、YA087（F）、YA099（G）、YA093（H）、YA218（I）和YA223（J），同时选择了1份未产生中和抗体的样本YA132（A）。对上述10位患者从最初感染至感染一年半之后的系列血浆样本进行中和抗体检测，所选假病毒为较难中和的CRF01_AE亚型假病毒，包括：GX24.8、GX71.18、BJ5.11和SHX346.6。发现4位患者D、E、F和I能够中和多株病毒，产生了亚型内的交叉保护中和抗体，其中E患者中和广谱性和中和抗体滴度最好。因此，我们将YA086（E）和YA132（A）分别作为产生和未产生广谱中和抗体的两类患者进行后续分析。 我们构建了YA086（E）和YA132（A）两位患者不同时间点的膜蛋白准种库，分别为E2、E5、E7、E9、E10和A2、A6、A8、A11，每两个时间点的时间间隔约为30周。对其序列分析，发现E患者相对于A患者有更高的序列多样化（p<0.05）及离散程度。 接下来，用已知单克隆抗体对两位患者的系列假病毒进行中和，得出两位患者的病毒株对单抗2F5、4E10、2G12和b12的中和无区别，所有被测假病毒均对2F5和4E10敏感，对2G12和b12耐受；然而，E患者的绝大部分毒株和A患者的所有被测毒株均对PG9/16敏感，仅极少数E患者毒株对其耐受。序列分析表明，毒株对PG9/16的耐受可能与H173Q突变有关。 从不同时间点血浆对不同时间点假病毒的中和反应得出，随感染时间延长，E和A患者中和抗体滴度均上升，但E患者比A患者有更强的自体中和抗体反应，且出现的更早、更快。此外，E患者自体中和抗体反应形成的动态变化和该患者基因多样性的动态变化一致，且二者均在最后一个时间点达到峰值，说明了中和抗体和病毒是共同进化的，即中和抗体的产生依赖于病毒膜蛋白的不断变异，变异的膜蛋白诱导新的抗体，新的抗体又催生膜蛋白新的变异，在这样相互作用与往复积累的过程中，抗体不断成熟，最后发展成为广谱中和抗体。 为了寻找与E患者体内广谱中和抗体产生相关的分子因素，在E患者中挑选出一株敏感株（E2-13）和一株耐受株（E10-3），对其C1C3区、C1V3区、V1C3区、C1V2区、V1V3区、V1V2+C3区、V1V2区和C3区进行相互的嵌合突变，并用E患者最后时间点的血浆（E10）进行中和，发现E10对E2-13(E10-3 C1C3)和 E10-3(E2-13 C1C3)中和滴度与其对原始株 E10-3和 E2-13无差异，因此得出C1C3区的序列变化是E患者广谱中和抗体产生的重要贡献者。接着，对E患者系列时间点 C1C3区的序列纵向分析，发现最初和最末时间点间存在8个位点的突变，即Q85P、146NITDEVKIG、H183P、K340E、354N、L364S、L368I和I371V。我们进一步构建了E2-13（E10-38个位点）和E10-3（E2-138个位点）嵌合株，前者对E10血浆的敏感性降低，后者敏感性升高，但均未降低和升高到其对原始株E10-3和E2-13的水平，说明这8个突变位点在广谱中和抗体产生中发挥了关键但不完全的作用。 同时，模拟患者体内病毒变异情况，利用制备的HIV-1膜蛋白质粒准种库，采用电穿孔的方式对豚鼠进行序列免疫，未成功诱导中和抗体产生。 本课题基于对产生与未产生广谱中和抗体患者的分子与免疫学特征比较，得出广谱中和抗体的产生是自体中和抗体与病毒基因多样化相互作用的结果。并进一步通过对产生广谱中和抗体患者体内敏感株与耐受株的改造，发现 C1C3区及有限的表位特异性是该患者血浆广谱中和活性的原因，为候选疫苗的抗原选择提供依据。