【摘 要】
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昆虫丰富的体色模式不仅具有观赏性,而且一直是生物学研究的一个重点。黑化是昆虫的主要着色模式,在昆虫适应性进化方面起重要作用。目前,昆虫黑色素合成代谢途径已被系统地研究,但相关调控网络及其分子机制仍有很多空白有待进一步研究。最新发现cortex基因控制桦尺蠖、袖蝶等多种鳞翅目昆虫的体色模式,然而cortex基因在体色形成过程的功能和分子机制尚不明确。本课题组先前对家蚕sml黑蛾的研究,也证明了家蚕c
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目:家蚕黑化代表型突变体的分子机制研究（项目编号:31372379）； 国家自然科学基金面上及重点项目No.31830094； 重庆市博士后科研特别资助项目:利用家蚕研究"工业黑化"现象调控基因功能及作用机制（项目编号:Xm2017149）； 中央高校基本科研
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昆虫丰富的体色模式不仅具有观赏性,而且一直是生物学研究的一个重点。黑化是昆虫的主要着色模式,在昆虫适应性进化方面起重要作用。目前,昆虫黑色素合成代谢途径已被系统地研究,但相关调控网络及其分子机制仍有很多空白有待进一步研究。最新发现cortex基因控制桦尺蠖、袖蝶等多种鳞翅目昆虫的体色模式,然而cortex基因在体色形成过程的功能和分子机制尚不明确。本课题组先前对家蚕sml黑蛾的研究,也证明了家蚕cortex基因（Bmcortex）控制蚕蛾的黑化表型。本研究选择家蚕sml黑蛾及野生型品系作为研究材料,通过扫描电镜、透射电镜分析微观结构,利用转基因过表达技术、CRISPR/Cas9基因组编辑技术、Co IP等手段对Bmcortex基因功能及分子机理进行了初探,主要研究结果如下:1.家蚕野生型与sml黑蛾鳞毛微观结构及Bmcortex的表达特征分别使用扫描电镜和透射电镜对蚕蛾鳞片进行微观结构分析,发现:与野生型Dazao相比,sml黑蛾鳞片上下表层沉积了大量的黑色素;但是黑色素的沉积并未对鳞片的纵脊、横肋以及孔窗大小和排布等微观结构产生显著影响,并且雌雄个体鳞片间也未见明显的结构差异。我们全方面地调查了Bmcortex基因在野生型Dazao品系中的时空表达模式。时期表达模式分析结果显示:Bmcortex基因在幼虫期和变态期的表达量相对偏低,但在胚胎初期、蛹末期和成虫期高量表达;组织表达模式分析结果显示:Bmcortex基因在精巢和卵巢的表达量显著高于其他组织,暗示Bmcortex基因除了在蚕蛾色素沉着方面的功能外,可能在生殖、胚胎发育等过程行使重要功能。。2.Bmcortex的转基因过表达（表型回复实验）和基因敲除我们构建了含有Flag标签蛋白的Bmcortex过表达转基因载体,并且成功获得了在sml黑化蛾中过表达Bmcortex的转基因阳性个体,调查转基因个体的表型,发现:在sml黑化蛾中过表达Bmcortex基因,蚕蛾体色变浅。另外,构建了用于CRISPR/Cas9基因敲除实验的Bmcortex基因g RNA转基因载体,并且在野生型Dazao中,成功获得了Bmcortex基因的g RNA转基因阳性个体。目前已将g RNA转基因阳性个体与Cas9转基因阳性个体进行了杂交,以供Bmcortex基因敲除个体筛查（实施中）。3.Bmcortex互作蛋白鉴定及Bmcortex基因调控体色的分子作用机理分析分析发现Bmcortex基因编码一个典型的WD40结构域蛋白,该类蛋白通常能支持蛋白复合体的组装或介导蛋白之间的瞬时相互作用。我们推测,Bmcortex蛋白可能结合其他蛋白形成蛋白复合物,进而间接或直接调控黑色素合成。因此,我们选用已构建的Bmcortex-Flag融合蛋白转基因过表达品系为材料,在蚕蛾体色形成的关键时期,取蛹翅,利用Co IP技术钓取Bmcortex的互作蛋白,并通过Q Exactive蛋白质谱鉴定了与Bmcortex蛋白特异结合蛋白。结果显示,可能与Bmcortex蛋白特异性结合的蛋白包括:酚氧化酶亚基2、蛋白激酶、过氧化氢酶、热激蛋白以及表皮蛋白和核糖体蛋白等等。已知酚氧化酶类蛋白参与多种昆虫的色素生物合成过程,并且在黑色素合成通路中发挥重要的催化作用,与昆虫的黑色素形成密切相关。综上推测:Bmcortex蛋白可能在鳞毛着色关键时期通过与酚氧化酶等黑色素合成路径上的关键功能蛋白结合方式,抑制其生成黑色素,间接控制蚕蛾体色的深浅。本研究对家蚕Bmcortex基因功能及分子机理进行了有效的初步探究,相关实验结果以及获得的转基因材料,为Bmcortex基因调控体色的分子作用机理的深入研究奠定了重要基础。
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