论文部分内容阅读
神秘果原产于西非，果实中含有一种能改变人的味觉、使酸味变成甜味的蛋白，称之为神秘果素。神秘果素可解决糖尿病病人无法进食甜味的问题，同时神秘果素能延长降糖药物的作用时间，可作为糖尿病的辅助治疗药物。天然神秘果素资源有限，无法满足市场需求。本研究希望通过植物和细菌基因工程的方法解决这个问题，主要研究结果如下。
1、神秘果素的信号肽对其原核表达的影响。构建含神秘果素信号肽基因的原核表达载体pET30c-fMIR，转化到大肠杆菌BL21中，诱导表达，但无目的蛋白产生。
2、原核表达条件的优化。优化菌种pQE30-mMIR/M15的表达条件，37℃下用0.2 mM IPTG诱导6h，表达量达到最大，但重组蛋白均为包涵体形式。
3、最低溶解浓度的筛选。分别探讨了用尿素和不同pH水溶液溶解包涵体时的最低尿素浓度和水溶液最低pH。当尿素浓度为5M和水溶液为pH11.5时，可将包涵体充分溶解。
4、保存时间对包涵体蛋白稳定性的影响。当5M尿素和pH11.5水溶液保存包涵体时，24 h内包涵体几乎都没有降解。
5、筛选合适的复性液。设计不同的复性液配方，溶解包涵体后，测其在405nm的吸光度，获得最佳复性液为:50 mM Tis-HCL，20 mM NaCl，10％甘油，10 mM EDTA,0.3 M L-Arg,1 mM GSH,0.1 mM GSSG。
6、降低溶液pH复性。用pH11.5的水溶解包涵体后，逐渐降低水溶液的pH值，用非变形聚丙烯凝胶电泳分析，发现当pH降低到6和5.5时，有明显的二聚体蛋白形成。
7、紫甘薯的转化。菌种pCanG-fMIR/LBA4404，用OD0.4的菌液，侵染紫甘薯“广紫一号”无菌苗茎段，共培养两天后，转化到分化筛选培养基，再经生根筛选，获得再生植株，经PCR鉴定，获得了5棵阳性植株。