鸭A-FABP基因cDNA克隆与基因多态性的研究

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沉积在肌肉内的脂肪是影响肉质和风味的一项重要经济性状。肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)被认为与肉质及口感呈正相关,影响肉质的多汁性、嫩度及风味。脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein,FABP)基因在动物体内脂肪代谢过程中的作用,与肌内脂肪含量等肉质性状显著相关,其中A-FABP (Adipocyte fatty acid bingding protein,A-FABP)和H-FABP (Muscle and heart fatty acid binding protein,H-FABP)已被证实是这些数量性状的候选基因,进行了重点研究。目前家禽育种工作已经取得了很大进展,然而高强度选择又带来了许多负面影响。其中控制脂肪在鸭体内的过多蓄积,提高鸭胴体质量和适口性是中国养禽业急需解决的问题。本研究把A-FABP基因作为鸭肌内脂肪含量的候选基因加以研究,旨在通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆并分析鸭A-FABP基因的结构与功能,利用聚合酶链式反应-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术分析鸭A-FABP基因的单核苷酸多态性,以阐明鸭A-FABP基因的遗传变异,继而以此为分子遗传标记进行辅助选择应用于鸭的育种,对降低鸭体脂、提高鸭肌内脂肪含量和改善鸭肉品质具有重要意义。为揭示鸭A-FABP基因的结构和功能,应用RACE技术首次克隆并鉴定了鸭A-FABP基因cDNA序列。首先用一对含高度保守的DNA片段的兼并引物,从鸭腹部脂肪组织总RNA扩增部分A-FABP片段,经验证与已知序列一致;接着测序并设计新引物分别从5’和3’RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,经SEQMAN软件拼接5’RACE产物和3’RACE产物以及已知序列获得片段大小为652bp的cDNA序列。与鸡A-FABP基因进行BLAST比对分析,结果表明该652bp的cDNA序列由5’-UTR区、CDS区和3’-UTR区组成,其中CDS区长度为399bp,5’非编码区长度为64bp,3’非编码区长度为189bp。包含完整的1、2、3、4外显子序列,与鸡A-FABP基因序列4个外显子一样也分别编码24,58,34和16个氨基酸。鸭A-FABP基因399bp的开放阅读框编码132个氨基酸,推导和分析氨基酸序列表明,分子结构与鸡A-FABP相似,其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。利用DNAMAN软件比较核苷酸序列,与猪、鸡和鹅的A-FABP基因分别有78%、95%和98%的同源性。根据RACE获得鸭A-FABP基因的cDNA序列,设计引物P0,扩增出该基因的第二内含子序列,在此基础上又设计3对引物利用PCR-SSCP方法对获得的序列进行多态性研究。结果引物P1在北京鸭、缙云麻鸭等品种中发现4处单碱基突变,分别为:386处“A-T”突变:388处的“T-C”突变;403处的“T-C”突变;444处的“C-T”突变。这些点突变共产生了3种基因型,且基因型在各鸭品种间的分布有显著差异。
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