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造血干细胞是一种成体干细胞，它可以进行自我更新、维持静息状态及向下游分化形成各系成熟的血细胞。造血干细胞自身功能的维持对于机体整个血液系统的稳态至关重要。造血干细胞的自我更新、增殖或者分化能力的异常是导致白血病、骨髓衰竭综合症及贫血等人类血液疾病的主要原因。调控造血干细胞功能的关键基因及信号通路在胚胎发育早期的造血干细胞的发育过程中也同样重要。因此我们研究早期造血干细胞发育历程、揭示调控其发育的分子调控机制对于理解血液疾病的发病机制、血液病的治疗手段的开发具有重要的意义。 斑马鱼是一种研究发育与疾病的良好模式生物。它体积小、发育速度快、产卵量高，特别适合进行人规模的遗传学筛选或者小分子药物筛选;斑马鱼的造血器官和调控造血干细胞发育的基因及信号通路与哺乳动物高度保守，对于斑马鱼造血干细胞发育调控机制的认知可以直接应用到哺乳动物当中;人们已经利用斑马鱼建立了众多人类血液病的疾病模型，这对于血液病的研究提供了良好研究基础。 前向遗传学方法是一种极具开创性的研究手段。通过对基因组的饱和式打击，可以筛选得到大量调控造血干细胞发育的新基因，建立新的血液病的斑马鱼模型。 我在之前的前向遗传学筛选的工作基础之上，利用cmyb基因作为造血干祖细胞的标记物，通过全胚胎原位杂交的手段，筛选和维护了11家造血干细胞发育异常的斑马鱼突变体，其中有1个家系造血干祖细胞数量异常增多，其余10个家系造血干祖细胞的数量异常减少乃至缺失。我对两个具有人类贫血表型相类似表型的斑马鱼突变体LDD488突变家系和cas002突变家系进行了深入的研究。对于LDD488突变家系，其突变表型为造血干祖细胞及下游的各个系的血细胞数量都异常减少，但是在基因的定位过程中发现该突变体的突变基因位于19号染色体的端粒位置，由于目前对于该位置的基因组测序还未完全拼接成功，导致对突变基因的定位无法继续进行。在cas002突变家系中，负责核糖体18s rRNA的合成及小亚基组装的重要基因krill发生了功能丧失性突变，导致核糖体功能受损，引起了造血干祖细胞中过度自噬的发生。我们进一步的分析了在cas002突变家系中核糖体功能受损、过度自噬及造血衰竭三者之间的关系，发现核糖体功能的异常导致蛋白质合成受到抑制，错误折叠或者未折叠的蛋白质积累，引发UPR（unfolded protein response）反应，进一步激活了PERK-eIF2a信号通路，引发了细胞过度自噬，最终导致造血干祖细胞的增殖速率减缓和造血衰竭。我们利用自噬的抑制剂3-MA及Baf A1可以恢复造血干祖细胞的增殖速率和造血衰竭的表型;同时，利用PERK的抑制剂GSK2656157可以抑制造血干祖细胞的过度自噬，恢复造血衰竭的表型。至此，通过对cas002突变体的研究分析，我们建立了人类再生障碍性贫血疾病的斑马鱼模型并揭示了其P53非依赖性的致病机理，直接针对自噬过程的小分子抑制剂（BafA1、3-MA）或利用PERK信号通路的小分子抑制剂GSK2656157等有效恢复了斑马鱼再生障碍性贫血模型中造血干细胞增殖能力，揭示其应用于相关血液疾病靶向治疗的潜在价值;基于造血干细胞过度自噬的临床检测有望成为相关疾病临床诊断的有效手段。 另外，我们还获得了一个带有tprb基因突变的突变体cas007。在cas007中，tprb基因单个碱基的颠换（G到C）导致编码的第9位氨基酸由亮氨酸变为缬氨酸，引起TPRB蛋白功能丧失。斑马鱼tprb基因是哺乳动物tpr基因的同源基因。TPR是核孔复合物的重要组成部分，位于核基质一侧，主要负责核质间的物质运输，同时对细胞分裂及一些基因的转录也有调控作用。cas007突变体的主要表型是红细胞数量异常增多并且发育减缓、阻滞，同时也有造血干细胞数量增多的现象。cas007突变体的红系表型与斑马鱼vhl突变体表型非常相似，vhl突变会引起HIF信号通路过度激活，并且我们在低氧条件下，在293T细胞中敲低tpr基因确实有HIF信号通路的激活，因此我们猜测HIF信号通路可能在cas007突变体中起到重要作用，针对该突变体的研究分析还在进行中。