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研究目的：
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRlSPRassociated protein9(CAS9)是一种来自于细菌的抵御病毒的免疫防御系统，后来被开发成具有高效靶向性和特异性的基因编辑技术，目前广泛应用于基因敲除，定向突变，基因激活，疾病模型构建和基因治疗等。基于C阳SPRlCAS9的人类疾病基因治疗的临床应用现己取得重大进展，其中一些也正在进入临床试验阶段。而作为外源蛋白的CAS9在应用到人类疾病治疗时的安全风险也一直倍受人关注。有研究报道在健康人体中发现了抗CAS9的抗体和抗原反应性T细胞，说明CAS9有潜在的免疫风险。此外基因编辑会导致基因组不稳定性，近几年多篇研究报道基因编辑可以引起广泛的染色体缺失，基因重排或突变，并且CRISPR技术可以激活p53介导的损伤反应，但具体机制不是十分清楚。大部分研究主要关注在外源gRNA存在条件下，DNA损伤反应的激活，而CAS9在缺乏gRNA时对基因组稳定性是否存在影响有待进一步研究。
研究方法：
1.利用Tet-on系统和慢病毒载体分别构建可诱导过表达CAS9质粒和稳定表达CAS9质粒，通过Western Blotting检测过表达CAS9后DNA损伤通路蛋白的表达变化。
2.运用彗星实验检测CAS9过表达细胞的DNA损伤情况。
3.利用cell counting kit-8评估H9过表达细胞系的细胞活力。
4.通过免疫荧光检测过表达CAS9后DNA损伤标志物γH2AX的表达情况。
5.构建检测HDR/NHEJ效率的Traffic Light Reporter(TLR)报告系统，利用流式细胞术评估CAS9对DNA修复效率的影响。
6.用含6-TG的培养基筛选田RT基因突变的细胞来评估CAS9对基因组稳定性的影响。
7.通过邻位连接技术(PLA)检测CAS9和KU86的相互作用。
8.通过免疫共沉淀检测CAS9、CAS9变异体及截断体和KU86的相互作用。
9.分别用免疫荧光实验、彗星实验及WB技术检测CAS9变异体对细胞DNA损伤状态的影响。
研究结果：
1.在H9和fibroblast细胞系中，诱导表达CAS9后p53和H2AX磷酸化水平均明显升高，且具有时间和剂量依赖性。稳定表达CAS9后也可诱导DNA损伤蛋白的激活。
2.彗星实验结果显示CAS9过表达组较对照组的DNA损伤更严重。
3.CCK8实验可以看出过表达CAS9后，细胞活力明显下降。
4.免疫荧光染色法检测出CAS9会上调DNA损伤标志物γH2AX表达水平。
5.流式细胞术结果显示CAS9会降低NH日修复效率，对HDR效率无明显影响。
6.CAS9过表达后基因HPRT自发突变率升高。
7.PLA和免疫共沉淀技术(CO-IP)均证明CAS9和KU86存在相互作用。
8.CQ-IP实验结果显示KU86与CAS9的PAM区的结合最强。
9.Cpf1、dCAS9和XCAS9同样可与KU86相互作用并介导DNA损伤标志物水平的增高。
研究结论：
CAS9可诱导DNA损伤并导致基因组不稳定，并通过结合KU86干扰DNA-PK复合体，使非同源末端连接NHEJ修复效率降低。CAS9的变异体Cpf1、dCAS9和XCAS9同样可以与KU86相互作用造成基因组DNA损伤。
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRlSPRassociated protein9(CAS9)是一种来自于细菌的抵御病毒的免疫防御系统，后来被开发成具有高效靶向性和特异性的基因编辑技术，目前广泛应用于基因敲除，定向突变，基因激活，疾病模型构建和基因治疗等。基于C阳SPRlCAS9的人类疾病基因治疗的临床应用现己取得重大进展，其中一些也正在进入临床试验阶段。而作为外源蛋白的CAS9在应用到人类疾病治疗时的安全风险也一直倍受人关注。有研究报道在健康人体中发现了抗CAS9的抗体和抗原反应性T细胞，说明CAS9有潜在的免疫风险。此外基因编辑会导致基因组不稳定性，近几年多篇研究报道基因编辑可以引起广泛的染色体缺失，基因重排或突变，并且CRISPR技术可以激活p53介导的损伤反应，但具体机制不是十分清楚。大部分研究主要关注在外源gRNA存在条件下，DNA损伤反应的激活，而CAS9在缺乏gRNA时对基因组稳定性是否存在影响有待进一步研究。
研究方法：
1.利用Tet-on系统和慢病毒载体分别构建可诱导过表达CAS9质粒和稳定表达CAS9质粒，通过Western Blotting检测过表达CAS9后DNA损伤通路蛋白的表达变化。
2.运用彗星实验检测CAS9过表达细胞的DNA损伤情况。
3.利用cell counting kit-8评估H9过表达细胞系的细胞活力。
4.通过免疫荧光检测过表达CAS9后DNA损伤标志物γH2AX的表达情况。
5.构建检测HDR/NHEJ效率的Traffic Light Reporter(TLR)报告系统，利用流式细胞术评估CAS9对DNA修复效率的影响。
6.用含6-TG的培养基筛选田RT基因突变的细胞来评估CAS9对基因组稳定性的影响。
7.通过邻位连接技术(PLA)检测CAS9和KU86的相互作用。
8.通过免疫共沉淀检测CAS9、CAS9变异体及截断体和KU86的相互作用。
9.分别用免疫荧光实验、彗星实验及WB技术检测CAS9变异体对细胞DNA损伤状态的影响。
研究结果：
1.在H9和fibroblast细胞系中，诱导表达CAS9后p53和H2AX磷酸化水平均明显升高，且具有时间和剂量依赖性。稳定表达CAS9后也可诱导DNA损伤蛋白的激活。
2.彗星实验结果显示CAS9过表达组较对照组的DNA损伤更严重。
3.CCK8实验可以看出过表达CAS9后，细胞活力明显下降。
4.免疫荧光染色法检测出CAS9会上调DNA损伤标志物γH2AX表达水平。
5.流式细胞术结果显示CAS9会降低NH日修复效率，对HDR效率无明显影响。
6.CAS9过表达后基因HPRT自发突变率升高。
7.PLA和免疫共沉淀技术(CO-IP)均证明CAS9和KU86存在相互作用。
8.CQ-IP实验结果显示KU86与CAS9的PAM区的结合最强。
9.Cpf1、dCAS9和XCAS9同样可与KU86相互作用并介导DNA损伤标志物水平的增高。
研究结论：
CAS9可诱导DNA损伤并导致基因组不稳定，并通过结合KU86干扰DNA-PK复合体，使非同源末端连接NHEJ修复效率降低。CAS9的变异体Cpf1、dCAS9和XCAS9同样可以与KU86相互作用造成基因组DNA损伤。