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香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)引起的系统性维管束土传病害。病原菌从根部进入植物体内,通过堵塞维管束和分泌有毒物质危害寄主,造成植株叶片萎蔫和全株枯萎死亡。目前还没有理想的化学药剂可以控制枯萎病的发生,也没有有效的抗病品种,而对其生物防治的研究也刚刚起步。因此,了解尖孢镰刀菌古巴专化型致病相关基因对香蕉枯萎病的防控尤为重要。目前,通过DNA插入突变产生致病缺陷突变体,是初步了解基因的功能是否与致病相关的主要途径。近年来,丝状真菌致病相关基因的克隆与标记常用限制性内切酶介导整合转化技术(restriction enzyme-mediated integration, REMI)实现。本研究初步建立了一套较为系统的尖孢镰刀菌古巴专化型REMI转化体系,并对转化子表型进行初步分析。根据研究结果总结出尖孢镰刀菌原生质体的制备方法：将尖孢镰刀菌古巴专化型接种于PDA培养基上培养5 d,以无菌牙签挑取少量菌丝于PD培养液28℃、200 r/min培养2 d。过滤除去菌丝,获得孢子悬浮液。接种浓度为1×107 cfu/mL的孢子悬浮液1～2 ml到PD培养液中,28℃、120 r/min摇床培养12～14h。过滤、洗涤、收集菌丝,加入10 mg/ml溶壁酶和10 mg/ml崩溃酶组成的混合酶液,室温、70 r/min酶解2～3 h,过滤、洗涤、收集原生质体。100 ml菌丝培养液可以制备800μl浓度为(2～5)×107 cfu/mL的原生质体。本文利用CaCl2-PEG(polythylene glycol)介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescent Protein, GFP)转化入尖孢镰刀菌古巴专化型菌株B2-1中,获得了32个转化子,为进一步运用绿色荧光蛋白标记研究香蕉枯萎病病原菌的侵染过程奠定基础。对所得的32个转化子进行菌落表型观察及GFP表达检测,其中18个转化子在PDA固体培养基上的菌落形态与野生型菌株的菌落形态存在明显差异；在λ=488 nm下检测结果显示,32个转化子中有28个转化子有绿色荧光蛋白的表达,但其中4个转化子的荧光表达量相对较弱。另外,本文利用近年来发展起来的真菌限制性内切酶介导外源DNA插入突变技术,用含有HygB抗性标记的质粒pCX62与微管相关蛋白基因FEM1结合,在尖孢镰刀菌古巴专化型菌株B2-1中建立了一个转化体系,并获得了13个转化子。实验所得的13个转化子在PDA固体培养基上的菌落形态与野生型菌株的菌落形态存在差异,其中8个转化子的生长速度比野生型菌株有不同程度的减慢,且有2个转化子的菌丝量明显减少。