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研究背景： 脓毒症是感染引起的全身性炎症反应，是ICU患者的常见病症，病死率较高，受到急危重症医学专家的极大关注。有研究认为，线粒体功能障碍和由此引起的细胞能量代谢衰竭是脓毒症引起多器官功能衰竭的主要病理机制之一;研究发现，肝细胞线粒体内膜的水通道蛋白8（aquaporin-8，AQP8）对调节线粒体膜的水转运起着重要的作用，在生理状态下，AQP8对调节线粒体容量的改变和代谢物质的转运至关重要;同时在细胞凋亡诱导因子的作用下，AQP8还参与了线粒体渗透性肿胀的病理过程。线粒体功能障碍和全身性炎症反应的程度都与脓毒症病情的严重性及脓毒症患者的预后密切相关;近年来，脓毒症治疗靶点方面的临床研究是工作重点之一。以预防或逆转线粒体损伤的临床治疗为目标的研究已经取得了一些进展，尽管在干预治疗时机的选择和在治疗的效果与安全性之间的评估和如何避免该治疗方法是否会给患者带来其它附加伤害等方面研究结果仍然饱受争议。 川芎嗪的有效成分是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，它是中草药川芎的有效成分之一，有动物实验及人体内的研究证明TMP对脓毒症引起的急性肝损伤具有保护作用，其保肝作用的机制可能是通过TMP具有的灭活氧自由基、抗氧化作用可阻止脂质过氧化、保护具有抗氧化作用的酶如谷胱甘肽过氧化酶和谷胱甘肽还原酶等环节而起作用的;研究发现川芎嗪对肝细胞线粒体结构和功能的完整性具有保护作用。在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis faetor-α，TNF-α)介导的脓毒症实验动物模型中，肝细胞AQP8的表达可能通过其转录后抑制的机制而被下调，导致AQP8介导的水向线粒体外的转运功能下降，线粒体体积的快速膨胀，线粒体破裂;这种肝细胞线粒体肿胀和破裂的现象被认为是肝细胞在细胞凋亡诱导信号的刺激下，激活机体氧化磷酸化过度活跃的结果。本研究的目的是证实川芎嗪对脓毒症大鼠的肝细胞线粒体的结构完整性具有保护作用，这个作用是通过上调脓毒症状态下肝细胞线粒体内膜的AQP8蛋白表达来实现的。 方法： 48只SD大鼠被随机分为四组，每组12只。使用盲肠结扎穿孔(cecal ligationand puncture, CLP)的方法制备脓毒症实验动物模型，对照组接受假手术处理;脓毒症组实验动物仅进行CLP手术;治疗组实验动物在完成CLP手术后，立即从尾静脉注射盐酸川芎嗪注射液，剂量为60 mg/kg;预防组实验动物在从尾静脉注射60 mg/kg盐酸川芎嗪注射液7天后，进行CLP手术。在预实验时观察大鼠术后的存活时间;正式实验时观察大鼠手术结束至出现明显脓毒症症状所需的时间，在术后10小时，实验动物在苯巴比妥腹腔注射麻醉后从腹主动脉抽取2ml血液检测TNF-α，然后处死实验动物，实验动物肝脏被快速取出置于缓冲液冰水中。 取实验动物肝脏制备50nm厚度的电镜切片，使用4％的醋酸铀酰和0.5％的醋酸铅染色后，观察肝细胞线粒体的超微结构;使用Image-Pro Plus6.0软件计算每组实验动物单个肝细胞切面的线粒体数、单位面积肝细胞内的线粒体数和单位体积肝细胞内线粒体容积。分离肝细胞线粒体，制备肝细胞线粒体的裂解液，使用Western blot技术检测肝细胞线粒体膜AQP8蛋白的相对表达量;并分离线粒体总的RNA，应用实时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)技术检测肝细胞线粒体AQP8 mRNA的相对表达量，所有样本的AQP8 mRNA定量使用β-actin作为内参，资料分析使用iCycler IQ Real-timePCR检测系统软件进行。 使用流式细胞术检测线粒体膜罗丹明123的平均荧光强度(meanfluorescence intensity，MFI)，激发波长为488nm，发射波长为525nm，荧光信号强度使用FACS Diva软件进行记录并分析;应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)检测大鼠被处死前的血清TNF-α浓度。 使用SPSS14.0统计学软件包进行统计学分析。各组实验动物的存活时间、实验结束至出现脓毒症表现的时间、每个横切面的肝细胞线粒体总数、肝细胞不同区域单位面积内线粒体数、单位体积内的线粒体容积、AQP8 mRNA表达、AQP8蛋白表达、罗丹明123的荧光强度和TNF-α使用均数±标准差表示，用方差分析进行统计学分析;AQP8蛋白和AQP8 mRNA的表达与罗丹明123的荧光强度及TNF-α间的相关性使用直线相关性检验。 结果： 1.手术时间、手术结束至出现脓毒症症状的时间和实验动物存活时间比较脓毒症组实验动物的手术结束至出现脓毒症症状的时间较治疗组和预防组要短（P＜0.01），即TMP可以延缓实验大鼠脓毒症发作的时间;预实验观察治疗组和预防组的大鼠存活时间较脓毒症组大鼠为长（P＜0.01）;治疗组和预防组的实验动物比较出现脓毒症表现的时间和存活时间均无显著差异。对照组大鼠手术时间较另三组明显缩短（P＜0.01），CLP手术时间在另3组间无显著性差异（P＞0.05）。 2.线粒体结构的变化脓毒症组大鼠肝细胞线粒体的体积增大，嵴肿胀明显、空泡样变，甚至线粒体外膜破裂，发生脂肪变性。在治疗组和预防组，线粒体显著肿胀、空泡化改变，基质浓缩，脊变宽，胞浆内可见脂肪滴等变化均较脓毒症组减轻，且两组间并无显著性差异。和对照组比较，其它3组单个肝细胞切面的线粒体总数均减少（P＜0.01），但治疗组和预防组均多于脓毒症组(P＜0.01);脓毒症组的不同区域的平均线粒体数也较少（P＜0.01），但单位体积内的线粒体容量并无显著性差异(P＞0.05)。 3.肝细胞线粒体AQP8 mRNA的表达和对照组比较，脓毒症组大鼠肝细胞线粒体AQP8 mRNA的表达增加(P＜0.01);治疗组和预防组的线粒体AQP8 mRNA的表达低于脓毒症组(P＜0.01);而对照组、治疗组和预防组之间则没有显著性差异（P＞0.05）。 4.AQP8蛋白的表达和对照组比较，AQP8蛋白的相对表达量在其它3组明显减少(P＜0.01);治疗组和预防组的AQP8蛋白相对表达量较脓毒症组增多(P＜0.01)，在治疗组和预防组之间则没有显著性差异（P＞0.05）。 5.通过罗丹明123检测的肝细胞线粒体膜电位变化肝细胞线粒体膜电位用罗丹明123的MFI来表示，对照组肝细胞线粒体罗丹明123的MFI高于脓毒症组、治疗组和预防组(P＜0.01)，脓毒症组罗丹明123的MFI低于治疗组和预防组(P＜0.01)，治疗组和预防组之间则没有显著性差异（P＞0.05）。直线相关性分析显示，罗丹明123的MFI和AQP8蛋白表达呈正相关（P＜0.01），而罗丹明123的MFI与AQP8 mRNA之间呈负相关(P＜0.01)。 6.血清TNF-α 与对照组比较，其它3组实验大鼠的TNF-α血清浓度显著增加(P＜0.01)，TMP治疗组及预防组实验动物的血清TNF-α水平低于脓毒症组实验动物的血清TNF-α水平(P＜0.01)。TNF-α与罗丹明123的MFI呈负相关(P＜0.01)，与AQP8蛋白表达也呈负相关(P＜0.01);TNF-α与AQP8 mRNA表达呈正相关(P＜0.01)。 结论： 1.脓毒症状态下，肝细胞线粒体膜的AQP8蛋白表达下调导致线粒体膜电位降低，引起线粒体结构的破坏。 2.川芎嗪对脓毒症介导的肝细胞线粒体损伤具有保护作用，可能是通过上调AQP8蛋白的表达来稳定线粒体膜电位而起作用的。 3.川芎嗪并不是通过上调AQP8 mRNA的表达而上调AQP8蛋白的表达，可能是通过减轻机体的炎症反应起到上调AQP8蛋白表达的作用。 4.在脓毒症发生前即使用川芎嗪预防其效果并不优于出现脓毒症致病因素后使用川芎嗪治疗。