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目的肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病进展为肝硬化的必经过程,如何逆转HF是阻止肝炎向肝硬化发展的主要环节,肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)活化在发生HF中起重要作用,诱导其凋亡是防治HF的核心。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)途径是一种新的凋亡途径,衣霉素(Tunicamycin,TM)为ERS诱导剂,钙蛋白酶抑制剂(N-acetyl-Leu-LeuNorleucinal,ALLN)可阻断calpain-2,因此本研究应用TM和ALLN作用于转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激的大鼠HSC,从ERS途径探讨对HSC凋亡的影响,为抗纤维化的研究提供进一步的实验证据。方法取液氮冻存的大鼠HSC株,复苏后接种到完全培养基中培养。采用MTT法选定TM的剂量为2ug/ml,作用时间为24h,ALLN剂量为25u M。同步化之后将HSC分为4组:空白组、TGF-β1组(HSC+TGF-β1)、ALLN+TM组(HSC+TGF-β1+ALLN+TM)、TM组(HSC+TGF-β1+TM)。空白组用空白培养基培养,其余组用10ng/ml TGF-β1处理24h后,TGF-β1组更换空白培养基继续培养,ALLN+TM组用25u M ALLN预处理30min,和TM组同时加入2ug/ml TM,避光孵育24h。倒置显微镜观察HSC培养24h、48h、72h后的生长情况以及加入TGF-β1后HSC的形态改变,MTT法检测各组HSC增殖情况,吖啶橙-碘化丙啶(AO/PI)双染法检测HSC凋亡情况,透射电镜观察各组HSC超微结构,流式细胞仪检测HSC周期变化,激光共聚焦显微镜观察Ca2+浓度改变,免疫组织细胞化学染色法检测calpain-2、caspase-3的表达,Western Blot法检测α-SMA、GRP78、caspase-9、Bax、Bcl-2、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果1形态学:24h时HSC少量贴壁,48h时细胞贴壁数量增加,72h时生长至单层致密;加入TGF-β1后HSC呈长梭形改变,细胞间隙变大;2细胞增殖:各组HSC间增殖率的比较差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1组HSC增殖率明显高于空白组(P<0.05),ALLN+TM组和TM组明显低于TGF-β1组(P<0.05);3细胞周期:各组间G1期、S期、G2期HSC所占比例的比较差异均有统计学意义(P<0.05),TGF-β1组G1期、G2期所占比例明显低于空白组(P<0.05),S期所占比例则高于空白组(P<0.05),ALLN+TM组和TM组G1期细胞比例明显高于TGF-β1组(P<0.05),S期均明显低于TGF-β1组(P<0.05),G2期变化不显著(P>0.05);4 Ca2+浓度:各组HSC Ca2+浓度比较差异有统计学意义(P<0.05),空白组与TGF-β1组中Ca2+浓度差异不显著(P>0.05),ALLN+TM组和TM组Ca2+浓度明显高于TGF-β1组(P<0.05),ALLN+TM组Ca2+浓度明显低于TM组(P<0.05);5 AO/PI双染法:空白组和TGF-β1组大部分呈绿色荧光,ALLN+TM组中绿色荧光仍然占多数,部分呈现橙红色或橙黄色荧光,TM组橙红色或橙黄色荧光最多;6透射电镜:空白组和TGF-β1组HSC染色质分布均匀,ALLN+TM组微绒毛脱落,细胞器崩解成空泡,TM组染色质出现明显边集,呈“新月形区域”;7免疫组织细胞化学染色法:各组中caspase-3、calpain-2的比较差异有统计学意义(P<0.05),ALLN+TM组和TM组caspase-3、calpain-2的表达显著高于TGF-β1组(P<0.05),ALLN+TM组中caspase-3、calpain-2的表达显著低于TM组(P<0.05);8 Western Blot:TGF-β1组α-SMA表达明显高于空白组(P<0.05),各组HSC GRP78、caspase-9、Bax、Bcl-2以及Ⅰ型胶原蛋白的表达差异均有统计学意义(P<0.05),与TGF-β1组相比,ALLN+TM组和TM组的GRP78、caspase-9及Bax表达显著升高(P<0.05),Bcl-2、Ⅰ型胶原蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论1 TM可使HSC内Ca2+浓度升高,通过ERS诱导HSC发生凋亡,降低Ⅰ型胶原的表达进而逆转HF;2阻断ERS通路中calpain-2可阻抑TM诱导的HSC凋亡作用。