MUSTN1和PDK4基因在家禽肌肉组织发育过程中的功能研究

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完善的禽类肌肉发育机制是家禽肌肉性状分子育种过程中的理论依据。本研究采用胚盘下腔注射法向种蛋注射重组干扰质粒的手段,沉默MUSTN1和PDK4基因的表达。通过实时荧光定量PCR检测基因的差异表达情况,探讨MUSTN1和PDK4基因在肌肉发育过程中潜在的功能及其调控机制。具体结果如下:  (1)根据shRNA的设计原则设计干扰片段,经测序后确定成功构建重组干扰质粒pEGFP-C2_shMUSTN1和pEGFP-C2_shPDK4。通过凝胶阻滞实验确定重组干扰质粒/脂质体的包装比为1:2.5时包装效果最好。  (2)经免疫组化确定分离得到鸡胚成纤维细胞。转染及干扰效率检测表明,不同包装比的转染液均成功转染鸡胚成纤维细胞,且包装比为1:2.5时荧光信号最强。该结果与凝胶阻滞实验相一致,固以此包装比制备转染液。实时荧光定量PCR结果显示pEGFP-C2_shMUSTN1_1和pEGFP-C2_shPDK4_1重组质粒干扰效率最高且与对照组存在极显著差异(P<0.01)。  (3)通过胚盘石蜡切片确定转染液的注射量为2μl。发育6天胚胎基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示可以扩增出EGFP片段。发育2周的胚胎胸肌、心脏、肝脏和肾脏的石蜡切片结果显示,在胸肌和肝脏中可以检测到两种重组干扰质粒的荧光表达,在肾脏组织中可以检测到pEGFP-C2_shPDK4_1的荧光表达。而PCR结果也显示,在转染两种重组质粒的胸肌和肝脏中,以及转染pEGFP-C2_shPDK4_1的肾脏组织中可以扩增出EGFP片段,进一步证明转染成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,在被两种重组干扰质粒转染的个体内,第2、4、6和8周的目的基因相对表达水平显著下调并与对照组存在极显著差异(P<0.01),干扰效率满足实验要求。  (4)实时荧光定量PCR对IGF-1、MyoD和MyoG的检测结果显示,MUSTN1的低表达会在胚胎发育的第14天引起IGF-1的极显著下调表达(P<0.01);MyoD和MyoG在第4天和第14天的极显著下调表达(P<0.01);PDK4的低表达没有导致在发育6天和14天的胚胎组织中IGF-1、MyoD和MyoG的表达水平出现显著性变化。  根据上述实验结果并结合现有家禽肌肉方面的研究进展得出如下结论:MUSTN1的低表达导致IGF-1下调从而对PI3K/Akt的激活效应减弱,引发FoxO1去磷酸化,进而调控MyoD和MyoG下调表达,即MUSTN1可能对MyoD和MyoG具有正向调节作用;PDK4不直接参与肌肉早期的增殖和分化过程,而是通过磷酸化骨骼肌内的丙酮酸脱氢酶来调控三羧酸循环,进而调节肌肉内葡萄糖和脂肪酸的转化,从能量代谢的角度来影响肌肉的生长和发育。
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