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[目的]
通过研究胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的不同阶段细胞的MHC分子表达及激活免疫反应的情况,明确胚胎干细胞及其衍生细胞分化过程中的免疫原性变化规律和激活免疫反应的情况,为糖尿病细胞移植治疗的抗移植排斥策略的制定提供理论和实验依据。
[方法]
1.MEF的制备:取e13.5d的孕小鼠的胚胎,用75％酒精消毒后充分剪碎(1-3mm3),再用0.25%胰酶(Trypsin)-0.02%EDTA溶液消化成细胞悬液,离心收集细胞,制备成小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),经传代2代后纯化备用。
2.ESC的扩增:小鼠胚胎干细胞(ESC)接种于经丝裂霉素处理的饲养层MEF上,在含15%胎牛血清、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM高糖培养液中培养,每天换液一次,每3-4天按1:3-4比例传代扩增一次。
3.ESC向IPC分化诱导:
3.1拟胚体(embryonic bodies,EB)的形成:将培养3-4天的ESC用0.25%胰酶(Trypsin)-0.02%EDTA消化为单细胞后,接种于细菌培养皿,在不含LIF的DMEM高糖培养液中(含15%胎牛血清和O.1mM/Lβ-巯基乙醇),悬浮培养4-5天,使ESC自发分化为EB。
3.2 nestin阳性细胞(nestin positive cells,NPC)的形成:收集培养4-5天的EB,转种于Ⅰ型胶原蛋白包被过的培养板,在含15%胎牛血清、不含LIF的DMEM高糖培养液中培养24小时,待EB贴壁后更换为无血清的DMEM/F12培养液,添加N2、纤维连接蛋白、bFGF。隔天更换新鲜培养液一次。连续诱导培养2-3天可形成NPC。
3.3胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPC)的形成:NPC形成后,更换为含肝细胞生长因子、活化素-A、β-细胞素、烟酰胺、bFGF和不含血清的DMEM/F12的IPC诱导培养液,继续诱导培养,隔天更换新鲜培养液一次,至第4d,培养液中添加lOmmol/L浓度的葡萄糖,24h后更换为含葡萄糖20mmol/L的新鲜诱导培养基继续培养至IPC形成聚集为胰岛样细胞团(islet-like cell clusters,ICCs)。
4.各阶段细胞的鉴定:
4.1 ESC经集落的特殊形念和碱性磷酸酶染色鉴定。
4.2 EB经特定培养条件下形成的细胞团形态而鉴定。
4.3 NPC经其形态及nestin免疫组化染色鉴定。
4.4 IPC经其形态及双硫腙(DTZ)染色鉴定。
5.ESC向IPC分化各阶段细胞的免疫原性检测:
5.1 MHC表达的检测:ESC、EB、NPC和IPC,用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗体处理后流式细胞仪(FCM)分析,检测MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子自发性表达情况。为了了解IPC是否会受到某些增强免疫反应的细胞因子的刺激而出现MHC分子的诱导性表达,进行了IPC的γ-干扰素(IFN-γ)诱导表达实验,在IPC诱导培养基中加入IFN-γ后再分别培养1、3、5天,用FCM检测MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表达情况。
5.2混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture,MLC):将人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)作为反应细胞,ESC和各分化阶段细胞作为刺激细胞,按1×106反应细胞:1×105刺激细胞的比例将两种细胞混合,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中行单向MILC,培养4天后用EIASA法测定培养上清液中的IL-2的浓度,用MTS法检测淋巴细胞的增殖情况,了解淋巴细胞活化情况。
[结果]
1.用e13.5d的孕小鼠胚胎制备出的原代MEF在悬浮状态下呈圆形。培养24h后,贴壁细胞大部分呈长梭形纤维细胞样,细胞生长迅速,一般培养3d左右细胞生长汇合。原代的MEF中除有成纤维细胞外,还混杂有少量圆形细胞,细胞密集。传代纯化后的MEF形态为长梭形纤维细胞样,细胞纯净,不含其它杂细胞。
2.ESC接种于饲养层MEF上24h后,ESC细胞贴壁生长。每天更换新鲜培养液,ESC细胞生长迅速。3-4天形成致密圆形或椭圆形的ESC集落。
3.ESC向IPC分化诱导:
3.1悬浮培养4.5天,ESC自发分化形成团状EB。
3.2 EB诱导培养3-4天,形成了形念为上皮样细胞的nestin阳性细胞。
3.3 nestin阳性细胞形成后,再诱导培养6天以后形成了聚集为胰岛样细胞团(ICCs)的IPC。
4.各阶段细胞的鉴定:
4.1 ESC集落内细胞呈细小圆形,核大,细胞质少,细胞紧密聚集成团状隆起,细胞间界限不清,但集落周边与饲养层细胞有明显界限,呈致密圆形或椭圆形。ESC集落碱性磷酸酶染色呈阳性,ESC集落被染成为棕褐色。
4.2 EB呈圆形细胞逐渐增多并积聚成团,其表面有结节状突起。
4.3 NPC形态为大而扁平的单层生长的上皮样细胞,nestin免疫组化染色呈阳性,被染成棕褐色。
4.4 IPC为圆形细胞并聚集为胰岛样细胞团(ICCs)。ICCs的DTZ染色呈阳性,被染成棕红色。
5.各分化阶段细胞的免疫原性检测:
5.1 FCM分别检测ESC、EB、NPC和IPC的MHC分子自发性表达,实验结果显示ESC的MHC-Ⅰ分子表达为(2.13±0.1)%,EB的MH-Ⅰ分子表达为(3.01±0.3)%,NPC的MHC-Ⅰ分子表达为(5.15+0.5)%,IPC的MHC-Ⅰ分子表达为(8.52±0.4)%,它们均无MHC-Ⅱ分子表达。IPC的MHC分子的诱导性表达实验结果显示,不加IFN-γ、加入IFN-γ后诱导培养1天、加入IFN-γ后诱导培养3天和加入IFN-γ后诱导培养5天的IPC的MHC-Ⅰ分子表达分别为(8.24±0.3)%、(10.08±0.2)%、(11.50±0.4)%和(13.00±0.5)%,各组均无MHC-Ⅱ分子表达。
5.2单向MLC培养4天后,经E13SA法测定培养上清液中的IL-2的浓度,结果显示经PHA刺激的hPBL的IL-2水平明显增高,IL-2的浓度为.524.9±7.8 pg/ml;而经ESC刺激的淋巴细胞的IL-2水平无显著变化,IL-2的浓度为55.3±5.7pg/ml:但经EB、NPC、IPC刺激的淋巴细胞IL-2的水平也出现增高,IL-2的浓度分别为68.2±4.3 pg/ml、69.5±5.6pg/ml、70.5±4.1pg/ml。经MTS法检测淋巴细胞的增殖活性,结果显示hPBL被PHA有效刺激,其OD值为1.078±0.089,然而ESC、EB不能引起hPBL的明显增殖反应,其OD值分别为0.629±0.069和0.634±0.063,但NPC、IPC能引起hPBL较低的增殖反应,其OD值分别为0.654±0.078和0.692±0.076。
[结论]
1.本实验能获得增殖能力旺盛及纯化的MEF饲养层。采用MEF和LIF相结合的方法培养ESC,ESC扩增能力强。
2.本实验采用分阶段诱导方法,ESC经过连续培养诱导,可以在18天的时间内获得具有胰岛β-细胞特征的IPC。
3.ESC低表达MHC-Ⅰ分子,无MHC-Ⅱ分子表达,免疫原性低,体外培养条件下不能激活免疫反应。
4.EB的MHC-Ⅰ分子表达有所增加,不表达MHC-Ⅱ分子,体外培条件能使淋巴细胞激活,但不能引起明显的淋巴细胞增殖反应。
5.NPC的MHC-Ⅰ分子表达增高,仍无MHC-Ⅱ分子表达,体外培养条件下激活淋巴细胞的能力进一步增强。
6.IPC的MHC-Ⅰ分子自发性表达明显增高,但无明显MHC-Ⅱ分子表达。在IFN吖刺激下,IPC的MHC-Ⅰ出现诱导性表达,MHC-Ⅱ分子诱导性表达无明显变化。随着MHC-Ⅰ表达的增高,IPC激活淋巴细胞的能力进一步增强。