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第一部分大鼠海马神经元原代培养、形态学观察和纯度鉴定
目的：体外原代培养乳鼠海马神经细胞形态学观察和纯度鉴定。
方法：取新生24h之内的SD大鼠，酒精消毒后迅速取出海马组织，在解剖显微镜下去除软脑膜，采用浓度为0.125％的胰蛋白酶消化法加机械吹打法分离细胞，用无血清培养基进行细胞培养。采用细胞免疫化学法检测海马神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白A(GFAP)的表达，在显微镜下观察海马神经细胞的生长情况和纯度。
结果：无血清培养8d的海马神经细胞胞体饱满成锥体形且发亮，边缘有光晕，突起较多，末端彼此相互连接形成复杂的神经网络。光镜下观察，NSE表达阳性细胞为棕黄色，海马神经细胞纯度为(94.69±0.93)％；GFAP为阴性，表明神经胶质细胞较少。
小结：无血清培养8d的乳鼠海马神经元，纯度达90％以上，适用于细胞学实验。
第二部分 Bcl-2抑制剂对黄芪注射液增强缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经细胞活性的影响
目的：复制大鼠海马神经细胞缺氧缺糖/复氧复糖模型，检测Bcl-2抑制剂对黄芪注射液增强缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经细胞活性的影响，探讨黄芪注射液是否通过Bcl-2靶点发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的保护作用。
方法：用无血清培养液体外培养大鼠海马神经细胞。取培养8 d的海马神经细胞，随机分为六组：正常对照组、模型组(即：缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(即：无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组、Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。
除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖，各组于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h应用MTT法检测细胞活性。
结果：MTT检测结果显示：与正常对照组比，模型组海马神经元活性明显降低(P<0.05)；黄芪注射液溶剂对照组较模型组海马神经元活性无明显差别(P>0.05)；与模型组比，黄芪注射液治疗组海马神经元活性明显升高(P<0.05)，Bcl-2抑制剂组海马神经元活性明显降低(P<0.05)；与Bcl-2抑制剂组相比，Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组海马神经元活性明显升高(P<0.05)，而与黄芪注射液治疗组相比则无显著差异(P>0.05)。
小结：
1.黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的活性，对缺氧缺糖/复氧复糖损伤后的脑细胞有保护作用。
2.Bcl-2抑制剂可明显降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经细胞的活性，进一步促进神经细胞的凋亡。
3.黄芪注射液可对抗Bcl-2抑制剂降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经细胞的活性，推测Bcl-2可能是黄芪注射液发挥对海马神经元保护作用的靶点之一。
第三部分 Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3表达及活性的影响
目的：检测Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因Caspase-3表达的影响，旨在探讨黄芪注射液是否通过Bcl-2靶点发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。
方法：用无血清培养液体外培养大鼠海马神经细胞。取培养8 d的海马神经细胞，随机分为六组：正常对照组、模型组(即：缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液治疗组、黄芪注射液溶剂(即：无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组、Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖，各组均于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6h、24 h、48 h、72 h和120 h分别采用细胞免疫化学染色法及western blotting蛋白免疫印迹法检测海马神经元Caspase-3蛋白的表达，并采用RT-PCR方法检测海马神经元Caspase-3 mRNA的表达。
结果：免疫化学结果显示：正常对照组大鼠海马神经元层次清楚，胞体呈圆形或椭圆形，排列紧密，Caspase-3免疫反应阳性结构主要分布在胞膜和突起，呈棕黄色；与正常对照组相比，模型组大鼠的海马神经元细胞核增大，且胞质肿胀、胞浆大量黄染，胞核内散在黄色颗粒，同时在各个时间点海马神经元Caspase-3阳性表达均明显增强(P<0.05)；黄芪注射液溶剂对照组神经元形态学变化及海马神经元Caspase-3阳性表达情况与模型组无明显差异(P>0.05)；黄芪注射液治疗组的大鼠海马神经元仅有轻微核皱缩，部分神经元胞浆可见黄染，海马神经元Caspase-3阳性表达比模型组明显降低(P<0.05)；Bcl-2抑制剂组可见大量凝固性坏死细胞，细胞排列紊乱，胞浆几乎全部黄染，海马神经元Caspase-3阳性表达比模型组明显增多(P<0.05)；Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组大鼠海马神经元核皱缩稍重，突起回缩明显，可见大部分胞浆黄染，海马神经元Caspase-3阳性表达比Bcl-2抑制剂组明显降低(P<0.05)，而与黄芪注射液治疗组无明显差异(P>0.05)。Western blotting实验结果显示：与正常对照组比，模型组海马神经元Caspase-3蛋白的灰度值明显升高(P<0.05)，复氧复糖24 h灰度值最高；溶剂组与模型组海马神经元Caspase-3蛋白的灰度值在各点无明显差别(P>0.05)；与模型组比，黄芪注射液治疗组海马神经元Caspase-3蛋白的灰度值明显降低{俨<0.05)，Bcl.2抑制剂组海马神经元Caspase-3蛋白的灰度值明显升高(P<0.05)；与Bcl-2抑制剂组相比，Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组海马神经元Caspase-3蛋白的灰度值明显降低(P<0.05)，而与黄芪注射液治疗组相比无显著差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示：与正常对照组比，模型组海马神经元Caspase-3 mRNA的光密度值明显增加(P<0.05)，24 h光密度值最高，溶剂组与模型组海马神经元Caspase-3的光密度值无明显差别(P>0.05)，24 h光密度值最高；与模型组比，黄芪注射液治疗组Caspase-3 mRNA的光密度值明显降低(P<0.05)，Bcl-2抑制剂组海马神经元Caspase-3 mRNA的光密度值明显增加(P<0.05)；与Bcl-2抑制剂组相比，Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组海马神经元Caspase-3的光密度值明显降低(P<0.05)，而与黄芪注射液治疗组相比无显著性差异(P>0.05)。
小结：
1.黄芪注射液可降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3蛋白表达及Caspase-3 mRNA的表达。
2.Bcl-2抑制剂可增强缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3蛋白表达及Caspase-3 mRNA的表达。
3.黄芪注射液可对抗Bcl-2抑制剂增强缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Caspase-3蛋白表达及Caspase-3 mRNA的表达，推测Bcl-2可能是黄芪注射液发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡抑制作用的靶点之一。
结论：Bcl-2可能是黄芪注射液发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡抑制作用的靶点之一。