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目的:构建p-KPNA2、p-HBs Ag、p-HBs Agt三种质粒,通过分组分别转染Hep G2细胞、LO2细胞和293T细胞,探讨KPNA2过表达在rt A181T型乙肝病毒表面蛋白上调c-Myc表达过程中的作用。方法:(1)从Gen Bank中分别查找KPNA2、HBs Ag的m RNA序列,利用primer premier 5.0软件设计引物,应用RT-PCR方法获得目的片段,双酶切后与真核表达质粒连接,从而构建成p-KPNA2、p-HBs Ag质粒;(2)以构建好的p-HBs Ag质粒为模板,采用定点突变方法使其产生rt A181T突变以构建p-HBs Agt质粒;(3)分组与转染:①p-HBs Ag组、②p-HBs Agt组、③p-KPNA2组、④p-KPNA2+p-HBs Ag组、⑤p-KPNA2+p-HBs Agt组、⑥空载质粒组,共6组;分别转染Hep G2细胞、LO2细胞、293T细胞;(4)检测:转染48h后,采用Ligand绿色荧光染料染色技术检测KPNA2的细胞内分布;收集细胞总蛋白,western blot检测目的蛋白的表达并进行灰度值分析;收集细胞总RNA,RTFQPCR检测目的基因m RNA的表达。结果:(1)质粒双酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳检测,条带位置大小与目的片段一致;(2)p-KPNA2、p-HBs Ag和p-HBs Agt重组质粒测序结果符合实验要求;(3)三种质粒转染Hep G2细胞后,western blot检测结果显示,p-KPNA2+p-HBs Agt组和p-HBs Agt组的c-Myc表达都显著高于其他4组(P<0.05),说明rt A181T型乙肝病毒表面蛋白能够上调c-Myc表达;但p-KPNA2+p-HBs Agt组与p-HBs Agt组比较无明显差异(P>0.05)。(4)三种质粒转染LO2细胞后,western blot检测结果显示,p-KPNA2+p-HBs Agt组和p-HBs Agt组的c-Myc表达也显著高于其他4组(P<0.05),且p-KPNA2+p-HBs Agt组明显高于p-HBs Agt组(P<0.05),说明KPNA2过表达能够促进rt A181T型乙肝病毒表面蛋白上调LO2细胞中的c-Myc表达;(5)三种质粒转染293T细胞后,western blot检测结果显示,6组细胞的c-Myc表达水平无明显差异(P>0.05);(6)RTFQ-PCR结果显示,在LO2细胞中,p-KPNA2+p-HBs Agt组和p-HBs Agt组c-Myc的m RNA表达高于p-HBs Ag组(P<0.05),与结果(4)存在一致性。结论:KPNA2过表达能促进rt A181T型乙肝病毒表面蛋白上调正常肝细胞中的c-Myc表达。rt A181T型突变是慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯治疗中常见的耐药突变,且裸鼠皮下注射该突变株能够引起肿瘤形成。为防治耐拉米夫定和阿德福韦酯的突变所致的肝细胞癌,KPNA2值得进一步研究。