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目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球最常见的癌症之一,其在癌症中发病率和死亡率均位于前列,严重威胁着全人类的生命健康。目前对于结直肠癌的治疗以外科手术切除为主,辅助放、化疗等综合治疗措施,但随之产生的抗免疫、骨髓抑制、脏器受损、肿瘤细胞耐药等副作用,严重制约了放化疗的效果。天然药物具有复杂的成分、多重的作用靶点,对于肿瘤发展的多个环节会产生影响,同时其毒性较低,不容易产生肿瘤耐药,已成为结直肠癌辅助治疗方案重要的组成部分。蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)是从植物蛇葡萄根皮及叶中提取出的一种小分子黄酮类化合物,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用,而且能够诱导肿瘤细胞凋亡。近年研究发现自噬在肿瘤的治疗中也是非常重要的靶点,其与凋亡之间的关系对肿瘤的进程及治疗具有重要的影响,但是,蛇葡萄素对肿瘤细胞自噬和凋亡的调控尚不明确。因此,本研究以多种人结直肠癌细胞系作为研究对象,一方面基于色谱—质谱联用的代谢组学技术平台对蛇葡萄素干预人结直肠癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织代谢谱进行分析,筛选出与其抑制结直肠癌生长相关的差异性代谢物,并对其代谢通路进行分析,有助于从代谢层面上阐述蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机理。另一方面从细胞水平、组织水平及分子水平,探讨蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的调节以及相关的分子机制,为结直肠癌的治疗提供新的线索和途径,为蛇葡萄素抗肿瘤作用的进一步研究和开发利用提供理论参考。方法:(1)用不同浓度的AMP(6.25、12.5、25、50和100μg/ml)分别作用于人结直肠癌HCT-116、SW480、SW620、LOVO、Colo 205、LS174T细胞48、72及96 h,MTT法检测不同浓度的AMP对这些细胞增殖抑制率的影响。用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,克隆形成实验观察AMP对细胞克隆形成率的影响。用50μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞24 h,细胞创伤愈合实验观察AMP对细胞迁移能力的影响。(2)利用人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察AMP体内抗结直肠癌活性,组织切片HE染色观察AMP对动物主要脏器是否有毒性作用。(3)用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-TOFMS)非靶标代谢组学技术,研究人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤块组织样本,初步筛选与AMP抑制结直肠癌生长有关的差异代谢物,并通过KEGG通路富集分析其相关代谢通路。(4)用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,流式细胞分析仪观察AMP对细胞周期和凋亡的影响,倒置显微镜下观察细胞形态。吖啶橙(Acridine orange,AO)染色后,荧光显微镜下观察AMP对细胞中发出红色荧光的酸性自噬囊泡的影响。并用电镜观察AMP对人结肠癌HCT-116细胞自噬的影响。免疫印迹法(Western-blotting)分析25、50、100μg/ml的AMP对细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白BCl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响。(5)分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,MTT法检测自噬抑制剂和促进剂与AMP合用后对细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,荧光显微镜下观察自噬抑制剂和自噬促进剂与AMP合用后细胞中酸性自噬囊泡的红色荧光比例。Western-blotting分析细胞中抗凋亡蛋白BCl-2和促凋亡蛋白Bax的比率,以及Cleaved-Caspase-3的表达,同时分析细胞中自噬标志物LC3、自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达的变化。(6)Western-blotting分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中PI3K,p-mTOR、Total-mTOR,p-Akt,Total-Akt及p-P70S6K、Total-P70S6K蛋白表达的影响。结果:(1)体外抗肿瘤实验表明,AMP对受试的六种结直肠癌细胞均有显著的抑制作用,且具有浓度依赖性。在48、72、96 h作用点,AMP对人结肠癌HCT-116、SW480及Colo 205细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,对人结肠癌SW620、Lovo及LS174T细胞而言,作用72 h时,增殖抑制作用最强,此后,随时间延长抑制作用逐渐降低。克隆形成实验和细胞创伤愈合实验表明,AMP能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成能力,抑制细胞迁移。(2)体内抗肿瘤实验表明,200 mg/kg的AMP能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤的生长,具有良好的体内抗结直肠癌活性。对动物的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏指数均无明显影响,组织切片HE染色结果显示,动物重要脏器组织无明显异常。(3)基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-TOFMS)非靶标代谢组学技术平台,对人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤组织代谢谱进行了检测,筛选差异性代谢产物,涉及三羧酸循环、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氨基酰tRNA的生物合成等通路。(4)流式细胞仪分析结果显示,AMP能够将人结肠癌HCT-116、SW480细胞阻滞于G1期,干扰细胞的有丝分裂,使细胞生长停滞。同时,细胞凋亡率明显增加。AO染色后,荧光显微镜下可见细胞内红色荧光比例明显增加,电镜下可见细胞胞浆中出现了双层或者单层膜包绕着线粒体等细胞器的自噬小体和自噬溶酶体。Western-blotting分析结果显示,AMP作用后,细胞和瘤块组织中BCl-2/Bax比率下调,Caspase-3剪切活性片段Cleaved-Caspase-3的表达上调,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1及Atg5蛋白的表达均显著增加。(5)AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞增殖加快,与自噬促进剂RAPA合用后,细胞增殖减慢。细胞AO染色后荧光显微镜下可见,AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡的比例减少,而与自噬诱导剂RAPA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡比例显著增加。Western-blotting分析显示,3-MA与AMP合用,可以使自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及Atg5的表达降低,而RAPA与AMP合用后,这些蛋白的表达均明显增加。流式细胞术Annexin-PI双染结果显示,3-MA单独应用时,细胞凋亡率没有太大的变化,当其与AMP合用后,凋亡率明显低于AMP处理组。RAPA与AMP合用后,细胞凋亡率明显增加,高于AMP处理组。Western-blotting分析结果显示,3-MA与AMP合用后,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例没有显著变化,但Cleaved-Caspase-3的表达显著低于AMP处理组,RAPA与AMP合用后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例明显降低,Cleaved-Caspase-3的表达显著上调。(6)25、50、100μg/ml AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞以及HCT-116细胞移植瘤裸鼠模型后,细胞及瘤块组织中的PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K的表达均呈降低的趋势。结论:(1)AMP具有显著的体外抗结直肠癌活性,能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成及迁移能力。(2)AMP具有显著的体内抗结直肠癌活性,且对动物的主要脏器无明显毒性。(3)AMP主要影响结直肠癌组织异常的能量代谢,特别是氨基酸代谢。(4)AMP能够形成结肠癌细胞G1期阻滞,诱导细胞凋亡和自噬。(5)自噬能够促进AMP诱导的细胞凋亡作用,与凋亡合作,共同促进细胞死亡。(6)AMP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。