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脑卒中作为常见的缺血/低氧相关疾病,已成为我国三大致死性疾病之一,但目前临床上对其治疗尚缺乏有效的措施。1986年,美国学者Murry对狗心脏组织缺血预适应(IPC)这一内源性保护现象的报道,为临床治疗此类疾病提供了新思路。缺血/低氧预适应(I/HPC)即预先给予机体亚致死性的缺血/低氧刺激,可明显提高组织对缺血/低氧性损伤的耐受能力。随后的研究发现,间歇、短暂地阻断颈动脉血流也可明显减轻后续脑缺血导致的豚鼠海马Cal区神经元的死亡,并由此引发了人们对脑I/HPC研究的兴趣。已有大量研究报道其可通过缓解多种损伤机制,如兴奋性毒性、离子或pH失衡、氧化应激、代谢功能失调、炎症反应、凋亡和死亡等,起到脑神经保护作用。其中,蛋白激酶C(PKC)介导的信号通路受到了大家的关注。多数的研究提示,PKC介导这一作用具有亚型特异性。本课题组以往的研究发现,经典型PKC(cPKC)βⅡ、γ和新奇型PKC(nPKC)ε及其相互作用蛋白参与了HPC诱导的脑神经保护作用。然而,以前的研究主要集中在脑HPC形成过程中细胞内PKC信号转导通路的激活,研究PKC亚型特异性信号通路蛋白水平的改变是否参与了延迟HPC和脑缺血损伤的过程,有利于我们对延迟脑HPC机制的认识。微小RNA(miRNA)作为一类小的、非蛋白质编码的、长度为21-23个核苷酸的RNA分子,主要通过转录后水平调节特定基因的蛋白表达,引起了我们的关注。在本研究中,我们应用高通量miRNA微阵列和生物信息学分析方法,鉴定HPC和6h大脑中动脉阻塞(MCAO)致缺血性脑卒中小鼠脑内差异表达的miRNAs、构建其对PKC亚型特异性相互作用蛋白的调控网络,同时对部分特定差异miRNAs进行了生物学功能验证,为寻找参与HPC脑神经保护作用的可能信号分子提供实验依据。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIHPublicationNo.80-23)进行。实验动物分组如下:正常对照组(Control)、假手术对照组(Sham)、低氧预适应组(HVC)、大脑中动脉阻塞(MCAO)致缺血性脑卒中组(Ischemia,I)和低氧预适应后缺血性脑卒中组(HPC+I)。收集Control、Sham、和HPC组脑皮层,以及Ischemia和HPC+I组缺血半影区脑组织,进行总RNA的提取、质量鉴定,应用miRNA芯片方法观察HPC小鼠脑皮层和MCAOdx鼠脑缺血半影区miRNAs的差异表达;应用基因本体论(GO)及京都百科全书基因和基因组(KEGG)等生物信息学方法,分析特定差异miRNAs靶基因在功能和通路上的显著性变化;基于特定差异miRNAs与其靶基因的调控关系,构建特定miRNAs-cPKCβⅡ、γ和nPKCε相互作用蛋白的调控网络。最后,在细胞水平上,利用氧-糖剥夺(OGD)模拟细胞缺血模型,验证miR-615-3p对OGD诱导N2A细胞损伤的影响。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理,以均数±标准误(X±SE)表示,其中P＜0.05为差异显著。实验结果如下:
1.总RNA质量的评估
所有样品总RNA的260nm和280nm吸光度比值(A260/A280)在1.8-2.2范围内,琼脂糖凝胶电泳图像显示,28SrRNA和18SrRNA两条带清晰,没有明显的降解。结果提示,本实验提取的小鼠脑皮层和细胞内总RNA的纯度和完整性符合下面芯片和qRT-PCR实验的要求。
2.HPC和MCAO对小鼠脑皮层内miRNAs表达的影响
根据miRNAs微阵列分析,在656个miRNAs探针中,与Control组相比,HPC组小鼠脑皮层组织内鉴定出17个miRNAs的表达发生了明显改变,其中4个miRNAs上调,13个miRNAs下调(p＜0.05,n=12pergroup)与Sham组相比,Ischemia小鼠脑缺血半影区内鉴定出65个miRNAs的表达发生了显著变化(P＜0.05,n=12pergroup),其中26个miRNAs上调,39个miRNAs下调;与Ischemia组小鼠脑缺血半影区相比,HPC+I组小鼠脑缺血半影区内有33个miRNAs的表达发生明显变化(p＜0.05,n=12pergroup),其中11个miRNAs上调,22个miRNAs下调。基于DiffScore=±13(p=0.05),我们进一步分析得到19个miRNAs在上述每两组内均发生变化。在这些特定的miRNAs中,let-7g*、miR-144、miR-297a、miR-30c-2*、miR-465c-5p、miR-466a-5p、miR-466f、miR-615-3p、miR-654-5p和miR-679在HPC组小鼠脑皮层和HPC+I小鼠脑缺血半影区内均下调,提示这10个miRNAs的改变可能由于HPC引起的。miR-30a在HPC组小鼠脑皮层和Ischemia组小鼠脑缺血半影区内上调,而miR-598在HPC组小鼠脑皮层和Ischemia组小鼠脑缺血半影区内下调,提示这两个miRNAs的改变可能由缺血损伤引起。miR-134、miR-181b、miR-22*、miR-331-3p、miR-378、miR-665和solexa-231-1844在Ischemia组小鼠脑缺血半影区和HPC+I组小鼠脑缺血半影区均发生明显改变。有趣的是,HPC处理可以缓解小鼠脑缺血半影区前6个miRNAs的下调,抑制后1个miRNA的上调,提示这些miRNAs可能在HPC对抗小鼠脑缺血半影区损伤中起着重要的作用。
3.实时定量RT-PCR验证HPC和MCAO小鼠脑组织内差异表达的miRNAs
为了验证miRNAs芯片所获结果的准确性,我们从上述19个特定差异表达的miRNAs中选择了miR-615-3p、miR-30a、miR-378和miR-331-3p等4个miRNAs,使用实时定量RT-PCR技术进一步检测其在Control、HPC、Sham、Ischemia和HPC+I五组小鼠脑皮层和缺血半影区内表达情况。所获结果与miRNAs芯片数据一致,即miR-615-3p在HPC组小鼠脑皮层和HPC+I组小鼠脑缺血半影区内下调;miR-30a在HPC组小鼠脑皮层和Ischemia组小鼠脑缺血半影区内上调;miR-378和miR-331-3p在Ischemia组小鼠脑缺血半影区和HPC+I组小鼠脑缺血半影区均发生明显改变,且HPC预处理可以缓解小鼠脑缺血半影区这两个miRNAs的下调。
4.使用GO功能注释和KEGG富集分析等生物信息学方法构建19个特定miRNAs对PKC亚型特异性相互作用蛋白的调控网络
首先,我们解析19个特定miRNAs靶基因的显著性生物学过程和分子功能。在得到41个显著GO功能注释的基础上,结合我们前期功能蛋白组学结果,进一步分析19个特定miRNAs调节cPKCβⅡ、γ和nPKCs相互作用蛋白在GO功能上的显著性富集。同时,借助KEGG通路数据库,分析19个特定miRNAs调节的靶基因中具有显著性意义的通路。生物信息学分析结果获得了28个显著性通路,其中代谢通路、MAPK信号通路、细胞周期、凋亡、氧化磷酸化等重要信号通路的-logP＞10。其次,我们重点分析19个特定miRNAs调节的cPKCβⅡ、γ和nPKCs相互作用蛋白参与的显著性通路。同时,根据miRNA及其靶基因的调控关系,我们构建19个特定miRNAs对cPKCβⅡ、γ和nPKCs相互作用蛋白的调控网络图。通过对调控网络图的拓扑分析,得到19个特定miRNAs可能通过调节cPKCβⅡ、γ和nPKCs相互作用蛋白参与HPC或脑缺血损伤过程。其中,miR-615-3p可以调节14-3-3γ,,并且14-3-3γ和PKCβⅡ、γ和nPKCs亚型都有相互作用,提示miR-615-3p可能通过调节14-3-3γ在HPC保护缺血脑组织中发挥重要的作用。
5.miR-615-3p在OGD诱导的N2A细胞损伤中的作用
应用OGD模拟体外细胞缺血损伤模型,我们采用噻唑兰(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)方法检测OGD诱导的N2A细胞损伤情况。结果显示,2hOGD后细胞活力降至76.1%(p＜0.05,n=6pergroup),4hOGD进一步增加细胞损伤。
为了研究miR-615-3p在缺血损伤中的作用,首先,我们使用功能获得和功能丢失的方法,即N2A细胞内转染miR-615-3p的前体和拮抗剂的核苷酸片段。实时定量RT-PCR检测发现,和溶剂对照组相比,转染miR-615-3p前体明显增加N2A细胞内miR-615-3p表达水平(4.1197±0.442955,n=6);转染miR-615-3p拮抗剂显著降低N2A细胞内miR-615-3p表达水平(0.268±0.05229,n=6)。随后,进一步研究miR-615-3p对OGD诱导的N2A细胞损伤中的影响。MTT结果表明,和溶剂对照组相比,转染miR-615-3p前体显著降低2h(0.617±0.02075,n=6)和4h(0.2288±0.01123,n=6)OGD后细胞存活;miR-615-3p拮抗剂可以明显提高2h(0.8564±9.85e-3,n=6)和4h(0.606±0.018,n=6)OGD后的细胞活力。同时,LDH结果表明,和转染溶剂对照组相比,转染miR-615-3p前体显著增加2h(0.3292±0.0169,n=6)和4h(0.8786±0.0232,n=6)OGD后细胞损伤;miR-615-3p拮抗剂可以明显降低2h(0.1256±0.0193,n=6)和4h(0.3210±0.0300,n=6)OGD引起的细胞损伤。结果提示,miR-615-3p可以促进OGD引起的N2A细胞损伤。
总之,我们的结果表明19个miRNAs在HPC和MCAO致局部脑缺血小鼠脑皮层内表达发生明显变化;GO和KEGG分析表明19个特定miRNAs的靶基因参与41个显著性生物学功能和28条显著性通路;19个特定miRNAs可能通过调节PKCβⅡ、γ和ε相互作用蛋白参与脑缺血/低氧损伤和适应的发生发展过程;细胞水平的研究表明miR-615-3p加剧OGD诱导的N2A细胞损伤,提示其可能在HPC诱导的脑神经保护过程中发挥重要的作用。本研究成果进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤和适应信号转导机制的认识,并为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据,具有潜在的实用价值。