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目的:白介素-10(interleukin-10,IL-10)是最重要和最有效的抗炎细胞因子之一。中枢神经系统中有多种细胞可产生IL-10或表达IL-10受体,这提示IL-10可以通过作用于脑内相关细胞调节神经炎症反应。而研究表明帕金森病与神经炎症之间存在重要关联。另外,IL-10也存在抗凋亡作用,那么我们推测IL-10是否可以其抗炎和抗凋亡作用对帕金森病进行防治。因此本研究观察IL-10在PD发生发展过程中对神经炎症和多巴胺(dopamine,DA)能神经元缺失的影响,并对其作用机制和信号通路进行初步探讨,以明确IL-10对DA能神经元的保护作用,从而发掘IL-10的治疗潜力,为防治PD提供实验依据。方法:1.细胞培养:(1)中脑腹侧细胞培养:取大鼠胚胎14±0.5天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养,培养7天后备用。(2)中脑腹侧单纯神经元培养:取大鼠胚胎14±0.5天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养,用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长以获得神经元,培养7天后备用。(3)中脑腹侧神经元-小胶质细胞共培养:取新生大鼠大脑皮层组织进行原代细胞培养,12-14天后获取小胶质细胞加入已培养6天的神经元,24 h后备用。(4)中脑腹侧神经元-星形胶质细胞共培养:取新生大鼠大脑皮层组织进行原代细胞培养,12-14天后去除小胶质细胞,至少4次传代获取星形胶质细胞加入已培养6天的神经元,24 h后备用。2.上述四种培养体系中,IL-10抑制LPS诱导的神经炎症和DA能神经元缺失的检测:用IL-10(15,50或150 ng/m L)预处理培养物1 h后再加入LPS(50 ng/m L)作用8 h(检测凋亡相关蛋白表达)或24 h。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能和非DA能神经元的数目,PCR和Western blot方法检测培养物中炎症介质(i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α)和神经营养因子(BDNF、IGF-1和GDNF)的水平,ELISA方法检测培养上清中IL-1β、TNF-α或IGF-1的浓度。另外,中脑腹侧细胞培养体系中,应用化学比色法检测上清中NO和H2O2的浓度;中脑腹侧单纯神经元培养体系中,应用免疫荧光双标法观察LPS受体TLR-4在神经元(Neu N+)上的定位情况,Western blot方法检测培养物中促凋亡酶(活化的caspase-3和caspase-9)的蛋白表达,原位末端标记法检测神经元凋亡率。3.中脑腹侧细胞培养体系中,IL-10抑制MPP+诱导的神经炎症和DA能神经元缺失的检测:用IL-10(15或50 ng/m L)预处理培养物1 h后再加入MPP+(5μM)作用24 h。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元的数目;Western blot方法检测培养物中炎症介质(i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α)和神经营养因子(BDNF、IGF-1和GDNF)的表达;ELISA方法检测培养上清中IL-1β、TNF-α和IGF-1的浓度。4.中脑腹侧单纯神经元培养体系中,IL-10抑制MPP+诱导的神经炎症和DA能神经元缺失的检测:用IL-10(15或50 ng/m L)预处理培养物1 h后再加入MPP+(5μM)作用8h或24h。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元的数目;Western blot方法检测培养物中活化的caspase-3和caspase-9的表达。我们设想IL-10可通过减少TNF-α,抑制细胞凋亡,减轻DA能神经元缺失,于是应用免疫荧光双标法确定TNF-α在受损DA能神经元的定位情况;Western blot方法检测培养物TNF-α的蛋白表达;ELISA方法检测培养上清中TNF-α的浓度。为确认TNF-α在MPP+诱导的神经炎症中的作用,我们进一步用中和性TNF-α抗体(1μg/m L)预处理培养物2h后,加或不加IL-10(50 ng/m L)处理1 h后,再加入MPP+(5μM)作用8 h或24 h。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元的数目;Western blot方法检测培养物中活化的caspase-3和caspase-9的表达。5.中脑腹侧单纯神经元培养体系中,IL-10通过神经元上IL-10受体和神经元内JAK-STAT3信号通路抑制LPS诱导的神经炎症和神经元凋亡的检测:首先,应用免疫荧光双标法确定IL-10Rα在神经元上的定位情况。其次,利用基因干扰技术沉默神经元上的IL-10Rα基因或用JAK抑制剂(0.5或1μM)预处理神经元1 h,之后IL-10(50 ng/m L)处理1 h后再加入LPS作用8 h或24 h。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元和非DA能神经元的数目;Western blot法检测培养物中COX-2、TNF-α、BDNF、GDNF、活化的caspase-3和caspase-9的表达;ELISA方法检测培养上清中TNF-α的浓度。另外,JAK抑制剂预处理的情况下,应用原位末端标记法检测神经元凋亡率;Western blot法检测磷酸化Stat3的水平。结果:1.中脑腹侧细胞培养体系中,IL-10减轻LPS诱导的神经炎症和DA能神经元缺失:LPS单独处理培养物可导致DA能和非DA能神经元数目减少,i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α水平升高,NO和H2O2浓度增加,BDNF表达降低,但IGF-1增加,GDNF变化不明显。IL-10预处理可明显减轻LPS产生的毒性作用。2.中脑腹侧细胞培养体系中,IL-10减轻MPP+诱导的神经炎症和DA能神经元缺失:MPP+单独处理培养物可导致DA能神经元数目减少,i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α水平升高,BDNF、IGF-1和GDNF水平降低。IL-10预处理可明显减轻MPP+产生的上述毒性作用。3.中脑腹侧神经元-小胶质细胞共培养体系中,IL-10减轻LPS诱导的神经炎症和DA能神经元缺失:LPS单独处理培养物可导致DA能和非DA能神经元数目减少,i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α水平升高,BDNF、IGF-1和GDNF水平降低。IL-10预处理可明显减轻LPS产生的上述毒性作用。4.中脑腹侧神经元-星形胶质细胞共培养体系中,IL-10减轻LPS诱导的炎症介质上调:LPS单独处理培养物,DA能和非DA能神经元数目变化不明显,i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α水平升高,同时BDNF基因、蛋白表达和IGF-1基因表达也增加。GDNF变化不明显,未检测到IGF-1的蛋白表达。IL-10预处理可明显抑制炎症介质的生成。5.中脑腹侧单纯神经元培养体系中,IL-10减轻MPP+诱导的神经炎症,DA能神经元凋亡和缺失:TNF-α与受损DA能神经元有共定位。MPP+单独处理培养物可导致DA能神经元数目减少,TNF-α、活化的caspase-3和caspase-9水平升高。IL-10预处理可明显减轻MPP+的上述毒性作用。中和性TNF-α抗体预处理培养物可降低培养物中促凋亡酶的表达,减轻DA能神经元缺失,但不能增强IL-10的作用。6.中脑腹侧单纯神经元培养体系中,IL-10通过与神经元上IL-10受体相互作用激活神经元内JAK-STAT3信号通路抑制LPS诱导的神经炎症和神经元凋亡:LPS受体TLR-4与Neu N有共定位,说明LPS可通过其受体直接作用于神经元。LPS单独处理培养物可导致DA能和非DA能神经元数目减少,COX-2基因表达、TNF-α水平、活化的caspase-3和caspase-9蛋白表达增加,BDNF、磷酸化的Stat3水平下降,神经元凋亡率升高,但COX-2蛋白表达和GDNF水平变化不明显。IL-10预处理可明显减轻LPS的上述毒性作用。未检测到i NOS、IL-1β和IGF-1的表达。IL-10Rα与Neu N有共定位。但沉默神经元上的IL-10Rα基因或JAK抑制剂预处理神经元后,IL-10不能减轻LPS诱导的神经元缺失,也不能减轻TNF-α和促凋亡酶的上调以及BDNF的下调。另外,JAK抑制剂预处理神经元后,IL-10也不能降低神经元凋亡率,不能减轻Stat3的磷酸化水平下调。结论:1.IL-10可通过作用于胶质细胞,下调炎症介质,上调神经营养因子,抑制神经炎症和多巴胺能神经元缺失,发挥保护神经元的作用。2.IL-10也可通过与神经元上IL-10Rα相互作用激活神经元内JAK-STAT3信号通路,下调炎症介质,上调神经营养因子,降低促凋亡酶水平,减少神经元凋亡,直接发挥保护神经元的作用。