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家蚕(Bombyx mori Linaeus)是具有我国特色的重要资源昆虫,目前有种桑养蚕的农户遍布20余省,丝绸工业的年总产值已经超过1000亿元,2003年以向仲怀院士为首的中国科学家在Science上首次报道了家蚕基因组框架图。该图覆盖了家蚕基因组95%的区域,获得了16948个完整的基因,7285个基因片段,该研究成果举世瞩目,为深入开展家蚕功能基因组研究奠定了基础。
鳞翅目昆虫除家蚕少数益虫外,很多是我国和世界各国农业和林业的重要害虫,如何有效防治害虫但不污染环境是当前生产中的难题,破解家蚕气味结合蛋白和化学感受蛋白在其嗅觉信号传递过程中发挥的作用,不仅可以指导蚕桑业的生产实践,也可以利用这种家蚕模式生物的相关研究结果,积极应用于鳞翅目害虫的防治。而昆虫触角感受器中的气味结合蛋白被认为是运输气味分子至嗅觉的受体,这些气味分子多为脂溶性的小分子化合物,气味结合蛋白溶解并运输脂溶性气味化合物。是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应,对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义。基于此,本论文开展了家蚕气味结合蛋白(OBPs)和化学感受蛋白(CSPs)基因的克隆、序列分析、原核表达载体构建的研究。
根据NCBI上已发表的家蚕的mRNA序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增了编码家蚕雌雄虫触角气味结合蛋白OBPs(登录号:PBP1:NM_001044029PBP2:AM40310.PBP3:NM_001083626(30BP1:NM_001044031 GOBP2:NM_001044033)和化学感受蛋白和CSPs(登录号:CSP1:NM_001043587 CSP2:NM_001043715 CSP3:NM_00.043599 CSP4:NM_001043597 CSP6:NM_00104360.CSP7:DQ855513 CSP8:NM_00104360.CSP10:NM_001043727 CSP12:NM_001098310 CSP14:DQ855520CSP15:NM_001098311 CSP16:NM_001098312)的cDNA片断,并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM-T Easy载体,获得了OBPs和CSPs基因成熟蛋白阅读框序列。
利用ExPAS3,在线分析工具对所得到序列进行分析,序列分析结果表明:家蚕OBPs分子质量一般约为15~17kDa,N-末端有一段20个氨基酸左右的信号肽,序列中有6个保守的半胱氨酸残基。这是大多数昆虫OBP的一个典型特征。在成熟蛋白上第40-60位约有20个亲脂性氨基酸,通常的模式为X18-Cys-X30-Cys-X3一Cys-X42一Cys-X8-10-Cys-X(X为任意氨基酸),这种结构可能与OBP结合脂溶性气味物质有关。6个半胱氨酸分别交叉形成3个二硫键,即Cys I=Cys III、Cys II=CysV和CysIV=CysVI。鳞翅目昆虫的PBP高度保守,它们之间表现出中等同源性,最高达57%,GOBP1与GOBP2之间比同一亚族内的同源性要低,如家蚕的GOBP1与GOBP2的同源性仅为51.8%。CSPs是一类分子质量约为13 kDa左右的水溶性球蛋白,有100~115个氨基酸残基,信号肽序列约20个氨基酸残基,有4个保守的半胱氨酸位点,形成2个二硫键。家蚕CSPs家族与其他昆虫CSPs家族具有相同的特点,约16~20个氨基酸的疏水N-末端,可编码信号肽,并且保守的半胱氨酸残基具有共同的空间模型,即Cys-X6-Cys-X18-Cys-X2-Cys(X代表任意氨基酸)。与OBPs相比,CSPs的保守性更明显,不仅同种昆虫CSPs保持较高的同源性,而且不同目、科昆虫之间也有较高的同源性。
将经Nco I和Xho I双酶切的OBPs和CSPs序列片段和同样经双酶切的原核表达载体pET-22b(+)连接重组后,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE电泳结果表明,家蚕OBPs和CSPs均获得较好表达。