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Pelo基因在精子发生、细胞周期、减数分裂以及mRNA降解中有重要的功能,但具体机制还并不是非常清楚。Pelo敲除的小鼠是胚胎致死的,酵母中Pelo的同源物Dom34敲除的酵母孢子生成也明显的受到影响,果蝇同源基因pelota突变导致果蝇的精子和卵子发生的缺陷,这些表型揭示Pelo可能调控发育过程中细胞的有丝分裂,但没有直接证据,具体机制也不明确。
组织特异性的基因条件性敲除技术使目的基因的敲除在区域上可人为控制,避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。该技术一般以Cre/LoxP系统为基础,Cre重组酶在特定的细胞类型中表达,介导相应细胞中两个Loxp修饰位点间基因的敲除。Pelo基因条件性敲除小鼠将为人们研究该基因提供了一个很好的平台与动物模型。
本论文采用经典的同源重组方法建立小鼠Pelo基因条件性敲除胚胎干细胞。在构建条件性敲除载体时,选择新霉素抗性基因Neo作为正筛选标记,白喉毒素基因DT为负筛选标记。敲除载体基因的两端各插入一个Loxp位点,5同源臂和3同源臂的长度分别设计为3kb和5kb。将构建好的条件性敲除载体线性化,通过电穿孔转染方法转入小鼠ES细胞中。经过G418连续7天的筛选,共挑取了27个细胞克隆。通过PCR鉴定,排除了非同源重组的ES细胞单克隆,成功获得了小鼠Pelo基因条件性敲除胚胎干细胞株3株,为以后囊胚注射从而得到基因条件性敲除小鼠奠定了基础。