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[目的] 前期研究已发现甘草酸具有预防小鼠骨质疏松的作用，但其作用机制尚不明确。甘草酸与甘草次酸存在显著的体内药代动力学差异，传统认为甘草酸的体内代谢产物甘草次酸是发挥药理作用的主要成分。本研究采用体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞探讨甘草酸与甘草次酸抗骨质疏松的作用机制，同时观察这两者是否存在药效学差异。实验通过检测细胞增殖活性、细胞周期分析、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成、钙磷沉积量、基因表达水平和基因组DNA甲基化水平等指标，评价甘草酸与甘草次酸对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响并探讨相关作用机制，为进一步研究甘草防治骨质疏松新用途提供科学依据。 [方法] 1.采用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，倒置相差显微镜观察原代和传代培养细胞形态特征和生长情况，取生长状态良好的第四代细胞用流式细胞仪免疫荧光双标记法检测细胞表面抗原，并用碱性磷酸酶染色和茜素红染色判断BMSCs能否向成骨细胞方向分化。 2.标准培养条件下，将骨髓间充质干细胞分为空白组（BLANK）、甘草酸组(Ga10-8、Ga10-7、Ga10-6)、甘草次酸组（Gca10-8、Gca10-7、Gca10-6），采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞PI染色法进行细胞周期分析，PNPP法检测细胞碱性磷酸酶活性。 3.成骨诱导培养条件下，将骨髓间充质干细胞分为空白组(B LANK)、成骨诱导组(OB)、成骨诱导+甘草酸组（OB+Ga10-8、OB+Ga10-7、OB+Ga10-6）、成骨诱导+甘草次酸组(OB+Gca10-8、OB+Gca10-7、OB+Gca10-6)，检测细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性，矿化结节茜素红染色并进行染色面积半定量分析，ICP法测定细胞钙磷沉积量，RT-PCR方法检测Dickkopf-3、β-catenin、Runx2和 OPG mRNA表达。 4.收集新鲜分离的骨髓细胞、P0～P4代BMSCs、空白组(BLANK)、成骨诱导组(OB)、成骨诱导+甘草酸组(OB+Ga10-8、OB+Ga10-7、OB+Ga10-6)、成骨诱导+甘草次酸组（OB+Gca10-8、OB+Gca10-7、OB+Gca10-6）细胞，提取基因组DNA，甲酸水解DNA后用液相色谱串联质谱检测基因组DNA甲基化水平。 [结果] 1.通过全骨髓贴壁法分离纯化得到形态较为均一的骨髓间充质干细胞，P4代BMSCs细胞表面抗原表达CD29+、CD90+（阳性率＞97％），CD45-(阳性率为0.3％)，成骨诱导培养BMSCs表达碱性磷酸酶并可形成矿化结节。 2.标准培养条件下，甘草酸与甘草次酸对BMSCs增殖活性无明显影响，仅在48h出现短暂的抑制作用;细胞周期分析显示低、中浓度甘草酸与甘草次酸组具有促进BMSCs增殖的作用，而高浓度甘草酸与甘草次酸具有抑制细胞增殖的作用;各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性呈时间依赖性升高，第3、7天各组ALP活性无显著差异，第11、15天甘草酸与甘草次酸组ALP活性高于空白组，但差异无统计学意义。 3.在成骨诱导培养条件下，甘草酸与甘草次酸对细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性无明显影响，仅第8天低、中浓度甘草酸有升高ALP活性的作用;甘草酸促进细胞矿化结节形成，而甘草次酸对细胞矿化结节形成无显著影响;低浓度甘草酸与高浓度甘草次酸组细胞钙、磷沉积量升高，而中浓度甘草酸和低浓度甘草次酸起相反作用，低浓度甘草酸使细胞钙磷比值最接近羟基磷灰石理论钙磷比值;甘草酸上调β-catenin、Runx2和OPG mRNA表达，下调Dickkopf-3 mRNA表达，而甘草次酸则下调β-catenin、Runx2和OPG mRNA表达，不影响Dickkopf-3mRNA表达。 4.P0至P4代BMSCs基因组DNA甲基化水平与细胞纯度呈中等程度相关，BMSCs基因组DNA水平明显低于骨髓细胞。 5.P4代BMSCs标准培养和成骨诱导培养0、6、12天，基因组DNA水平变化均呈现先升高后降低的趋势，甘草酸与甘草次酸显著降低成骨诱导培养BMSCs基因组DNA甲基化水平。 [结论] 1.采用全骨髓贴壁法可获得到纯度较高、生物学性状稳定的BMSCs，可为后续实验提供合格的细胞来源。 2.甘草酸与甘草次酸对细胞增殖活性、细胞周期分布影响不大，从碱性磷酸酶活性、矿化结节形成、钙磷沉积量和基因表达调控等评价成骨分化指标，对比分析甘草酸与甘草次酸进行药效学和作用机制的差异，表明甘草酸能促进BMSCs向成骨细胞方向分化，而甘草次酸则起抑制作用，甘草酸为体外促进BMSCs成骨分化的活性成分。 3.体外传代培养BMSCs具有基因组低甲基化模式的特点，基因组DNA甲基化水平检测可作为BMSCs的辅助鉴定手段。基因组DNA甲基化调控BMSCs成骨分化具有阶段性、双向性、动态且适度等特点。甘草酸与甘草次酸均可降低成骨诱导培养BMSCs基因组DNA甲基化水平，甘草酸可能通过适度降低基因组DNA甲基化起促进骨髓间充质成骨分化的作用，甘草次酸则因基因组DNA过度去甲基化反而起抑制作用。