论文部分内容阅读
第一部分转STGC3基因CNE2细胞系在雌雄性裸鼠体内成瘤的差异目的:前期初步研究发现,种植pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系的4只裸鼠,2只雌性裸鼠的移植瘤明显小于同组的2只雄性裸鼠,这一研究结果提示,雌激素可能具有促进STGC3基因对CNE2细胞的生长抑制作用。为验证上述实验结果,从体外观察雌二醇对STGC3基因高表达CNE2细胞系生长增殖的影响;扩大裸鼠样本,从体内进一步研究pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系裸鼠成瘤的性别差异。方法:将重组pcDNA3.1(+)/STGC3真核表达载体导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选,RT-PCR及Western blotting检测STGC3的表达,建立稳定高表达STGC3基因的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系。采用免疫组织化学法,检测CNE2细胞ER蛋白的表达。绘制细胞生长曲线,检测雌二醇(β-Estradiol)对转基因CNE2细胞生长增殖的影响。将pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞接种于裸鼠前肢背部皮下,分析雌性与雄性裸鼠成瘤的差异。运用RT-PCR、免疫组织化学及Western blotting方法,分别从mRNA及蛋白质水平,分析STGC3基因在裸鼠移植瘤组织的表达。移植瘤组织病理切片检查,观察瘤细胞形态学变化。施用流式细胞仪,测定移植瘤组织中细胞周期的分布。结果:免疫组织化学方法检测,ER蛋白表达定位于CNE2细胞的胞核和胞浆。细胞生长曲线结果显示,经雌二醇处理,pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞生长速度明显减慢(P<0.05)。体内裸鼠成瘤结果表明,接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2组移植瘤体积及重量均小于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);在转基因组中,雌性裸鼠组移植瘤体积和重量均小于雄性组,差异有显著性意义(P<0.05),雌性裸鼠组移植瘤生长最慢,而对照组移植瘤体积和重量均无性别差异,差异无显著性意义(P>0.05);接种转基因CNE2细胞的雌性裸鼠移植瘤中G0/G1期细胞数大于其他各组(P<0.05),表明细胞阻滞于G0/G1期。结论:1.雌二醇能够增强STGC3基因对CNE2细胞的生长抑制作用。2.转STGC3基因CNE2细胞系在裸鼠体内成瘤具有性别差异,雌性裸鼠成瘤能力较雄性弱,细胞阻滞于G0/G1期。第二部分转STGC3基因CNE2细胞裸鼠瘤组织蛋白质表达差异分析目的:接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的雌性裸鼠移植瘤体积和重量均小于雄性,细胞阻滞于G0/G1期。为进一步探讨其分子机制,本研究采用比较蛋白质组学的方法,筛选与鉴定接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌、雄性裸鼠移植瘤组织间的差异蛋白质分子。方法:采用双向凝胶电泳技术,分别分离pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌、雄性裸鼠移植瘤组织的总蛋白质,考马斯亮蓝染色、图像扫描、PDQuest软件分析,识别差异表达蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,获取差异表达蛋白质点的肽质量指纹图谱,Mascot软件搜索SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库,鉴定差异表达蛋白质,利用生物信息学资源,对所鉴定蛋白质功能进行初步分析。为了验证比较蛋白质组学研究的结果,应用Western blotting方法检测热休克蛋白70在转基因雌、雄性裸鼠移植瘤组织中的表达。结果:采用双向凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率好的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌性和雄性组移植瘤组织的双向凝胶电泳图谱。通过PDQuest软件匹配分析,pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌、雄性组移植瘤组织总蛋白质点数分别为:807±18和843±32,平均匹配率为87.2%。选择表达差异大于三倍及边界清晰的上调蛋白点,做好标记,从凝胶上准确切割后,酶解获得相关蛋白的肽质量指纹图谱,经Mascot软件上相关数据库查询,初步鉴定了在pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌性移植瘤组织中表达上调的5个蛋白质,在pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雄性移植瘤组织中表达上调的4个蛋白质点。其中在pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2雌性移植瘤组织中,表达上调的蛋白质有:延胡索酸酶、硫氧还蛋白过氧化酶、IgE依赖性组胺释放因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶WNK1和核糖体P0蛋白;表达下调的蛋白质有:热休克蛋白70、L-乳酸脱氢酶轻链、肌动蛋白素-1和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白。这些蛋白质涉及细胞骨架、细胞代谢、分子伴侣、免疫调节和信号通路等。应用Western blotting验证转基因雌、雄性裸鼠移植瘤组织中热休克蛋白70的表达,结果与比较蛋白质组学研究结果一致,说明比较蛋白组学结果较准确地反映了移植瘤组织蛋白质表达情况。结论:1.转STGC3基因CNE2细胞雌、雄性组裸鼠移植瘤蛋白质表达谱之间存在差异。2.初步鉴定了9个相关的差异蛋白质,在转STGC3基因CNE2细胞雌性组中,延胡索酸酶、硫氧还蛋白过氧化酶、IgE依赖性组胺释放因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶WNK1及核糖体P0蛋白表达上调;热休克蛋白70、肌动蛋白素-1、L-乳酸脱氢酶轻链和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白表达下调。3.上述蛋白质表达的改变,可能增强了STGC3基因对CNE2细胞系的生长抑制作用。