论文部分内容阅读
背景： 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病机制尚不清楚，T细胞及其亚群成为介导其致病过程的主要炎症细胞，Treg/Th17失衡和疾病的发生发展与转归密切相关。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可通过平衡Treg/Th17失衡发挥免疫调节作用，微泡（Microvesicles, MVs）是MSCs在静息或应激状态下产生的膜分泌体系，含有丰富的生物学信息。目前已证实，其能模拟其母体细胞的免疫调节及组织修复作用，可能成为RA治疗的新手段。 目的： 通过对RA动物模型即胶原诱导关节炎(Collagen-Induced Arthritis,CIA)大鼠的体内实验研究，观察hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠关节炎症状、影像学及病理变化的影响，对血清中促炎因子IL-17、抑炎因子TGF-β，脾脏T淋巴细胞增殖及凋亡指数，Treg/Th17,Treg细胞特异性转录调节因子FoxP3，Th17细胞特异性转录因子ROR-γT的调节作用，探讨其疗效及作用机制。 方法： 1. hUCMSC-MVs的分离及鉴定：对hUCMSCs“饥饿”培养24小时，差速离心法提取上清液中的微泡，使用透射电镜观察其形态，并使用 Nano Drop2000超微量分光光度计测定其蛋白质含量。 2.建立CIA模型：弗氏完全佐剂+II型胶原多点皮下注射免疫雌性Wistar大鼠，两周后腹腔注射再次建立CIA大鼠模型。大鼠随机分为以下7组，每组6只，即CIA模型组，hUCMSCs组，hUCMSC-MVs低、中及高浓度组，同时设立MTX组及正常对照组。 3.给药方法：再次免疫后次日进行干预。hUCMSCs尾静脉移植2×106/kg/鼠， hUCMSC-MVs分别尾静脉注射30ug/100μl、60ug/100μl及90ug/100μl/鼠，对照组给予等量的生理盐水，MTX组给予MTX0.9mg/kg/w腹腔注射。 4.检测指标：初次免疫后每周对各组大鼠体重、关节炎指数和后足肿胀度进行测定，42天时，留取后足影像学资料、外周血、脾脏及后足踝关节，流式多因子检测技术检测血清中IL-17、TGF-β的表达水平，流式细胞术检测脾脏T细胞增殖及凋亡指数，Treg、Th17细胞水平；同时对各组脾脏及关节组织制作病理切片，观察关节病理变化；免疫组织化学技术观察脾脏的Fox-P3及ROR-γT的表达情况，收集数据做统计分析。 结果： 1. hUCMSC-MVs的鉴定及对胶原诱导关节炎大鼠一般情况的影响 （1）hUCMSC-MVs的鉴定透射电镜观察，MVs为一类直径介于30nm-200nm之间大小不一的囊泡状结构，蛋白质浓度约为2.05μg/μl，符合目前国际公认的鉴定MSC-MVs的标准。 （2）hUCMSC-MVs对CIA大鼠体重的影响与正常对照组比较，CIA模型组大鼠体重增长程度明显降低（P<0.05），干预后有所改善，hUCMSC-MVs高浓度组有统计学差异（P<0.05），且高于低浓度组（P<0.05）。 （3）hUCMSC-MVs对CIA大鼠关节炎症状的影响 CIA模型组大鼠后足较正常对照组肿胀明显（P<0.05），关节炎指数明显升高（P<0.05）。各干预组后足肿胀有所减轻，关节炎指数下降，42天时仅MTX组有统计学差异（P<0.05）。 （4）hUCMSC-MVs对CIA大鼠踝关节影像学的影响与正常对照组比较，CIA模型组大鼠关节X线表现为关节间隙模糊，甚至狭窄，出现骨髓疏松，加强免疫后可见踝关节有虫蚀样破坏。干预后关节破坏有所修复，关节间隙及骨质疏松较前有所减轻，且高浓度组疗效明显，与hUCMSCs组及MTX组接近。 （5）hUCMSC-MVs对CIA大鼠踝关节病理的影响健康对照组大鼠关节腔结构清晰，无或少量滑膜增生及炎性细胞浸润；CIA模型组滑膜增生明显，大量炎性细胞浸润，部分出现软骨破坏。各干预组滑膜增生及炎性细胞浸润明显减少，且高浓度组优于hUCMSCs及MTX组。 2. hUCMSC-MVs对胶原诱导关节炎大鼠Treg/Th17及炎症因子的影响 （1）hUCMSC-MVs对CIA大鼠血清IL-17及TGF-β等炎症因子的影响 CIA模型组IL-17水平较正常对照组明显升高（P<0.05）,TGF-β水平有所下降。hUCMSC-MVs高浓度组IL-17水平与hUCMSCs及MTX组接近（P>0.05），明显低于低中浓度组（P<0.05）。中高浓度组、hUCMSCs及MTX组TGF-β水平接近（P<0.05）。 （2）hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏T淋巴细胞的影响 CIA模型组T淋巴细胞增殖水平高于正常对照组(P<0.05）；高浓度组与hUCMSCs组接近，高于MTX组（P<0.05）。CIA模型组T淋巴细胞凋亡水平明显降低（P<0.05）；各干预组均有所下降，且高浓度组、hUCMSCs及MTX组水平接近（P>0.05）。 （3） hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞、Th17细胞及Treg/Th17的影响与正常对照组比较，CIA模型组大鼠脾脏Th17细胞水平明显升高（P<0.05），Treg/Th17明显降低（P<0.05），而CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞水平有所降低，但无统计学差异（P>0.05）。各干预组Th17细胞水平均明显降低， Treg/Th17升高（P<0.05），中高浓度组对Th17细胞及Treg/Th17的调节能力与MTX组接近，优于低浓度组（P<0.05），且高浓度组抑制Th17细胞的能力优于hUCMSCs组（P<0.05）。hUCMSC-MVs高浓度组上调CD4+CD25+FoxP3+Treg水平的能力与hUCMSCs、MTX组接近（P>0.05），优于低、中浓度组（P<0.05）。 （4）hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏Foxp3及ROR-γT表达的影响 CIA大鼠脾脏ROR-γT的表达较正常对照组明显升高（P<0.05），FoxP3水平明显下降（P<0.05）。经hUCMSC-MVs干预后，ROR-γT表达明显降低，FoxP3水平升高（P<0.05），且高浓度组优于低中浓度组（P<0.05）。在调节转录因子ROR-γT方面，hUCMSC-MVs高浓度组与hUCMSCs组接近（P>0.05），优于MTX组（P<0.05）；而在调节FoxP3方面，hUCMSC-MVs高浓度组均优于hUCMSCs及MTX组（P<0.05）。 结论： 1. hUCMSC-MVs明显改善CIA大鼠体重减轻，抑制关节滑膜增生及炎症细胞浸润，发挥抗炎及组织修复作用。 2. hUCMSC-MVs通过抑制CIA大鼠脾脏T淋巴细胞增殖、促进凋亡，上调CD4+CD25+FoxP3+Treg水平，下调Th17细胞水平，平衡Treg/Th17比例发挥免疫调节作用，高浓度组不弱于hUCMSCs组，甚至在下调Th17方面更有优势；除对T细胞增殖的抑制作用弱于MTX组，余作用与其相当。 3. hUCMSC-MVs抑制CIA大鼠脾脏ROR-γT，促进FoxP3的表达，并减少血清中IL-17，升高TGF-β的水平，且高浓度组对炎症因子的调节作用不弱于hUCMSCs及MTX组；在调节转录因子方面，除对ROR-γT抑制作用与hUCMSCs组接近，余作用均优于hUCMSCs及MTX组。