【摘 要】
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将胚龄为14.5-16.5天(E14.5-16.5)的大鼠胎脑组织分离,研碎,培养于添加N2,B27,脂类,EGF和bFGF的DMEM/F12或Neurobasal-A,获得大鼠胎儿神经干细胞(rFNSCs),进行贴壁和悬浮生长
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将胚龄为14.5-16.5天(E14.5-16.5)的大鼠胎脑组织分离,研碎,培养于添加N2,B27,脂类,EGF和bFGF的DMEM/F12或Neurobasal-A,获得大鼠胎儿神经干细胞(rFNSCs),进行贴壁和悬浮生长的比较,并检测rFNSCs在无血清培养液DMEM/F12和Neurobasal-A中的生长情况,以及脂类,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对rFNSCs的影响.根据已知大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶(HPRT)基因的外显子序列,从大鼠HPRT基因组序列的细菌人工染色体(BAC)中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除戴体的3.0kb的长臂(Long Arm,LA)和1.7kb的短壁(Short Arm,SA),并分别克隆到pSL1180和pCR2.1中,其中短臂用EcoRI从pCR2.1载体切出,克隆到pKO中得到pKO-SA在用与构建基因敲除载体.经酶切鉴定后的大鼠HPRT基因敲除载体,用NotI酶切使其线性化,经溴乙锭、正丁醇、酚、酚氯仿提纯后,再于0.25μm Millipore上用TE水解2hr,回收DNA并将终浓度调至1μg/μl.在FuGene-6转染试剂的作用下转染培养24hr的第二代rFNSCs.转染后的细胞先在含80μg/ml G418和2μM Ganc的全培养液筛选,两星期后将存活细胞进行悬浮培养,使细胞形成球形物,挑选单个的球形物并使其分离,进行单克隆增殖.该研究为大鼠胎儿神经干细胞的分离提供了一种新的方法,并成功的构建了HPRT的基因敲除载体,而且获得了HPRT基因敲除的大鼠神经干细胞,为下一步通过核移植技术产生HPRT基因敲除的大鼠打下了一个很好的基础.
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