论文部分内容阅读
糖尿病发病率在世界范围内逐年上升,引起了世界各国的高度重视。目前治疗方式主要是利用药物控制血糖升高及防治并发症。由于中药具有低毒、降糖机制多元化的特点,成为降糖药物研究的热点。番石榴Psidiumguajava L.叶在我国有广泛分布,民间常用于防治糖尿病。研究证明番石榴叶富含黄酮类物质,而其降血糖作用与所含黄酮类物质有关。为了完善对番石榴叶降血糖有效部位及降血糖机制的研究,本论文摸索了番石榴叶有效部位总黄酮的提取纯化工艺,并考察了所提取的番石榴叶总黄酮对STZ糖尿病小鼠和STZ糖尿病大鼠血糖水平的影响;在此基础上,以STZ糖尿病大鼠为对象,从番石榴叶总黄酮对大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活力、抗氧化能力、葡萄糖代谢能力、胰岛素抵抗的影响等方面对番石榴叶总黄酮降血糖机制进行了探讨。旨在为扩大番石榴叶在临床的应用提供理论基础和技术支持。1.番石榴叶总黄酮提取纯化工艺的研究1.1经正交设计,以总黄酮含量为指标,确定了番石榴叶总黄酮最佳提取工艺条件,发现影响番石榴叶总黄酮提取效果的主次因素为:乙醇浓度＞回流时间＞提取次数＞溶剂用量,而番石榴叶总黄酮最佳提取工艺为:10倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次2小时。1.2番石榴叶总黄酮提取液浓缩后,经石油醚、乙酸乙酯初步纯化,用大孔吸附树脂进一步纯化。以动态饱和吸附量、动态洗脱率为考察指标,比较了D101、AB-8两种大孔树脂分离纯化番石榴叶总黄酮能力的优劣。又以总黄酮回收率为指标,从溶剂系统、洗脱速度、洗脱剂用量方面对筛选出的最佳树脂的吸附工艺参数进行了研究。发现在考察的2种树脂中,AB-8型树脂最适于番石榴叶总黄酮的分离纯化,其优化工艺条件为:4倍树脂体积50%乙醇洗脱,速度2 ml/min。经梯度洗脱及薄层层析分析发现,收集30%～50%乙醇区间洗脱液可进一步纯化番石榴叶总黄酮（TFPL）。1.3按所确定的最佳提取纯化工艺提取纯化的TFPL经定性分析,证实为黄酮类物质;薄层层析可见4个黄酮类物质斑点,其Rf值分别为0.84;0.67;0.55;0.41。其中Rf值0.84的斑点可能为槲皮素。按以上所确定的提取及纯化工艺进行提取,TFPL的提取率为0.31%±0.07（n=23）,所制备TFPL的平均纯度为89.46%±1.28;RSD=1.40%（n=23）。2.番石榴叶总黄酮对STZ糖尿病小鼠、大鼠血糖水平的影响2.1在STZ糖尿病小鼠模型上,观察TFPL对空腹血糖水平的影响,比较体重及心脏、肝脏、肾脏、和胰腺的脏器指数变化。共设糖尿病模型组、糖尿病+阳性降糖药物组、糖尿病+TFPL低（140mg/kg）、高剂量组（210mg/kg）、正常对照组等共5组,治疗14d后,模型组小鼠空腹血糖值达29.49±6.67mmol/L,TFPL低、高剂量组小鼠空腹血糖值分别降低至18.12±2.91、16.95±3.57 mmol/L;差异有显著性意义。说明TFPL可降低STZ糖尿病小鼠空腹血糖。但在各组STZ糖尿病小鼠的体重及脏器指数方面没有表现出显著性差异。2.2在STZ糖尿病大鼠模型上,考察TFPL对空腹血糖、淀粉负荷后血糖水平的影响,并检测了糖化血清蛋白、糖化血红蛋白的含量。共设糖尿病模型组、糖尿病+阳性降糖药物组、糖尿病+TFPL低（900mg/kg）、高剂量组（120mg/kg）、正常对照组等共5组,治疗8周后,模型组大鼠空腹血糖值达27.89±4.89mmol/L,TFPL低、高剂量组大鼠空腹血糖值分别显著性降低至21.76±2.27、17.27±2.43mmol/L。淀粉负荷1h、2h血糖分别从模型组大鼠的28.10±1.87、26.68±1.98 mmol/L显著性降低至TFPL低剂量组大鼠的24.20±1.60、19.55±1.18mmol/L,TFPL高剂量组大鼠的22.88±1.60、17.29±1.58mmol/L。TFPL低、高剂量组大鼠糖化血清蛋白、糖化血红蛋白的含量比模型组大鼠也均有显著性降低。说明TFPL可降低STZ糖尿病大鼠空腹、淀粉负荷后血糖,降低STZ糖尿病大鼠糖化血清蛋白、糖化血红蛋白的含量,对长期血糖控制有一定效果。3.番石榴叶总黄酮降血糖机制研究3.1提取正常SD大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶,以蔗糖、麦芽糖为底物,考察了TFPL对所提取小肠黏膜α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用,发现TFPL可抑制正常SD大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活力,对蔗糖酶及麦芽糖酶的抑制率分别达70%和60%以上,其IC50分别为2.01、1.96g/L。测定了药物治疗8周后的各组大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活性,发现模型组大鼠蔗糖酶及麦芽糖酶活性均较正常组大鼠有显著升高,而TFPL低、高剂量组大鼠中两种酶活性较模型组均有下降。以上实验说明TFPL可抑制正常及STZ糖尿病大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活性,从而延缓碳水化合物的消化吸收,达到降低血糖的目的。3.2增强机体的抗氧化能力是防治糖尿病及其并发症的一个重要方向。本实验以过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮和酶（NOS）活性及丙二醛（MDA）含量为指标,考察了TFPL对STZ糖尿病大鼠血清、肝组织、心肌组织抗氧化能力的影响。发现治疗8周后,模型组大鼠较正常组大鼠的CAT、GSH-PX、SOD活力均降低,而NOS活力及MDA含量增加,说明其抗氧化能力被损伤;与模型组比较,TFPL治疗组大鼠的CAT、GSH-PX、SOD的活力增高,NOS活力及MDA含量降低。说明TFPL可减少STZ糖尿病大鼠抗氧化能力的损伤。3.3糖尿病以葡萄糖代谢障碍为特点,增强糖代谢能力可改善高血糖及其引起的损害。本实验以肝、肌糖元含量及血清、肝丙酮酸激酶活性为指标,考察了TFPL对STZ糖尿病大鼠葡萄糖代谢能力的影响:模型组大鼠与正常组大鼠比较,肝、肌糖元含量下降,血清及肝组织PK活性下降,表现出葡萄糖代谢能力低下;而TFPL治疗组大鼠与模型组大鼠比较,其肝、肌糖元含量增加,血清及肝组织PK活性增加,说明TFPL可增强STZ糖尿病大鼠的葡萄糖代谢能力。3.4为了研究TFPL对STZ糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响,提取了各组大鼠肝、骨骼肌总RNA,合成相应cDNA,利用RT-PCR方法观察TFPL对大鼠肝胰岛素受体（ISR）、骨骼肌ISR、骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）mRNA表达的影响,发现模型组大鼠与正常组大鼠比较,肝ISR、骨骼肌ISR、骨骼肌GLUT4 mRNA表达均下降,而TFPL治疗组大鼠较模型组大鼠肝ISR、骨骼肌ISR、骨骼肌GLUT4 mRNA表达都有上调,说明TFPL可改善STZ糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。综上所述,本实验所确定的番石榴叶总黄酮提取纯化工艺稳定,所提纯的TFPL纯度高;经动物实验发现,所提纯TFPL可降低STZ糖尿病小鼠空腹血糖,降低STZ糖尿病大鼠空腹、淀粉负荷后血糖,长期血糖控制能力好。此外,实验发现TFPL可抑制正常大鼠和STZ糖尿病大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活性、抑制STZ糖尿病大鼠血清、肝、心肌组织CAT、GSH-PX、SOD、PK活力的下调、抑制STZ糖尿病大鼠肝糖元、肌糖元含量的下降、抑制STZ糖尿病大鼠NOS活力及MDA含量的增加,抑制STZ糖尿病大鼠肝ISR、骨骼肌ISR、骨骼肌GLUT4 mRNA表达的下调。说明TFPL可能通过以上机制发挥降血糖作用。