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辣椒素只有在辣椒属植物中才能合成,并且辣椒素应用广泛。通过对辣椒素的不断研究,辣椒素的生物合成途径已基本阐明,但是对辣椒素合成途径的调控机制却鲜有报道。本研究根据辣椒基因组数据及生物信息学方法筛选5个辣椒转录因子(AP2/ERF和WRKY),利用VIGS、q RT-PCR、酵母单杂交等技术对它们进行功能鉴定,期望找出具有不同辣度的品种间在这些转录因子上的差异,为挖掘“涮涮辣”高辣椒素基因奠定基础。得到的研究结果如下:(1)PCR初步检测得到了29株转CaAT3过表达的T0代转基因番茄。转化体的进一步鉴定正在进行。(2)不同辣度的辣椒品种的启动子序列比对结果如下:辣椒素合成途径中结构基因AT3的启动子中,‘59’(中辣品种)和‘WL’(微辣品种)只存在1个碱基的差异,‘740’(辣椒素含量最高的品种)和‘59’有较大差异;对‘59’,‘170’,‘740’,‘XN’(中辣品种)的p AMT启动子序列比较分析,发现‘59’和‘170’(甜椒品种,无辣椒素)只有1个碱基的差异,‘59’和‘XN’有3个碱基的差异,‘170’和‘XN’有2个碱基差异,而‘740’与其他3个品种的辣椒存在较大差异。对COMT启动子序列的比对发现在‘59’,‘170’,‘740’三个品种中只有‘170’和其余两个品种相差4个碱基,‘59’和‘740’比对后COMT启动子序列是一致的。KAS启动子序列比对发现不同辣椒品种之间差异较大,其中‘59’和‘170’相差11个碱基,‘59’和‘740’相差21个碱基,‘170’和‘740’相差26个碱基。(3)分离了“59”号辣椒的AT3,p AMT,COMT,KAS,PAL的启动子序列,并对它们进行了元件分析,发现这些基因的启动子序列都含有启动子核心元件及ERF和WRKY的识别序列。(4)根据Kim等(2014)对辣椒基因组测序结果,经过生物信息学分析,初步筛选出5个ERF转录因子,并依次命名为CaERF1,CaERF2,CaERF3,CaERF4和CaERF5。根据Qin等(2014)对‘Zunla-1’(Capsicum annuum L.)及其野生种‘Chiltepin’(C.annuum var.glabriusculum,also termed C.annuum var.aviculare)的基因组测序结果,经生物信息学分析,初步筛选出参与辣椒素合成的WRKY家族的5个基因,依次命名为CaWRKY1,CaWRKY2,CaWRKY3,CaWRKY4和CaWRKY5。(5)对‘740’自交系辣椒中转录因子ERF家族和WRKY家族的各5个基因进行表达分析,发现CaERF2和CaERF5在胎座中的表达量显著高于果肉,而CaERF3和CaERF4在果肉中的表达量都显著高于胎座。CaWRKY1,CaWRKY2在胎座中的表达量显著高于果肉,而CaWRKY3在果肉中的表达量显著高于胎座。(6)构建了上述10个转录因子的VIGS载体并进行了基因沉默处理,对辣椒ERF家族的5个基因分别进行沉默后,与CK相比,除CaERF3外,其余基因都在不同程度上得到了沉默。沉默后的CaERF1表达量约是CK的1/5,CaERF4和CaERF5的表达量约是CK的1/2,CaERF2沉默后的表达量和CK相近;与空载处理的PV2相比,沉默后CaERF1,CaERF4和CaERF5的表达量低于PV2,而CaERF2和CaERF3的表达量均高于PV2。与CK相比,AT3在沉默CaERF1,CaERF2,CaERF3后,表达量显著降低。经过VE1(沉默CaERF1)和VE2(沉默CaERF2)处理后,p AMT的表达量均低于CK,而沉默CaERF3,CaERF4,CaERF5后p AMT的表达量均比CK高,其中沉默CaERF3后p AMT的表达量最高。经过VE1、VE2、VE3(沉默CaERF3)处理后,FATA的表达量均高于CK,其中VE3处理的FATA的表达量是最高的。KAS的表达量只有在VE2处理下才低于CK,沉默CaERF1,CaERF3后,KAS表达量都高于CK。VIGS沉默WRKY家族的5个基因后效果不理想,没有进行后续分析。(7)VIGS处理后对辣椒素进行测定的结果显示,与p TRV2相比,经VE1(沉默CaERF1),VE2(沉默CaERF2),VE3(沉默CaERF3),VE5(沉默CaERF5)处理后,辣椒中辣椒素的含量均下降,其中VE1和VE3处理的辣椒素含量最低,处理VE4辣椒素的含量高于p TRV2。经过VIGS处理后,VE1,VE2,VE3,VE5处理的辣椒其二氢辣椒素含量均低于p TRV2,VE1处理的二氢辣椒素含量最低,VE4处理的二氢辣椒素含量高于p TRV2。(8)经过在线软件Ba Cel Lo对筛选出的辣椒ERF和WRKY家族的基因亚细胞定位预测后,结果显示筛选到的基因都定位于细胞核内。(9)在线软件MEME分析转录因子的保守区域,CaERF1有两个AP2保守结构域,属于AP2蛋白。5个WRKY基因都含有两个保守区域属于第二类WRKY。(10)酵母单杂交证明CaERF1,CaERF3,CaWRKY1,CaWRKY2能与CaAT3启动子结合。