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心肌肥厚、心衰是高血压、缺血性心肌病、心瓣膜病等许多心血管疾病的常见合并症,心肌肥厚、心衰常常伴发心律失常,特别是心衰期心源性猝死(SCD)的发生率大大增加。近年来,尽管在心衰的药物治疗上已取得很大的进展,但心衰病人的死亡率仍然较高。故揭示心肌肥厚、心衰病理过程中心律失常产生的分子机制,寻找有效的防治措施,是心血管领域研究的重要课题。迄今,已在多种心肌肥厚、心衰实验动物模型观察到瞬时外向钾电流(Ito)的下调。Ito是心室肌细胞复极化早期的主要电流成分,它是由α亚单位(Kv4.2、Kv4.3)和β亚单位(KChIP2)构成的离子通道形成。Ito密度的减小可来自通道动力学的改变和/或通道蛋白表达的减少,从而造成病理性动作电位(APD)延长。动作电位延长使心脏易发生早后除极产生触发活动及复极的离散度增大是心衰心律失常产生的重要原因。我们前期的实验表明,尽管心肌代偿性肥厚与心衰阶段均有小鼠乳头肌动作电位的延长,但两个阶段延长存在不同形式,前者以早期复极延迟为主,后者不仅有早期、而且存在晚期复极的延迟。提示心肌肥厚、心衰发展过程中电生理改变有随时间而变化的特征,而此种电生理进行性改变是否也伴有相应Ito离子通道的表达变化目前尚不清楚。本实验拟在已建立的小鼠心肌肥厚、心衰模型上,观察不同病理发展阶段小鼠心室肌内膜下(subEndocardial, Endo)、外膜下(subepicardial,Epi)心肌细胞Ito通道蛋白Kv4.2、KChIP2表达随时间变化的特点,并通过应用calcineurin(CaN)的特异性抑制剂环孢素A(CsA),探讨其病理性改变可能的细胞内信号传导通路,从分子生物学角度为心肌肥厚、心衰的电生理重构及机制提供实验依据。一、心肌肥厚和心衰不同时期小鼠左心室游离壁内、外膜下心肌细胞Kv4.2、KChIP2的表达变化目的:观察在压力超负荷性心肌肥厚和心衰发展过程中,小鼠左心室游离壁内膜、外膜下心肌细胞Kv4.2、KChIP2蛋白在不同时间点的表达变化情况。方法:(1)动物模型制备:将小鼠深麻醉后开胸,暴露主动脉弓,部分分离:用外径0.4mm针头与主动脉弓平行结扎,抽出针头,使主动脉弓狭窄65%-70%。术后左心室后负荷增加,血液流出受阻,造成压力超负荷性心肌肥厚和心衰的动物模型;观察动物的一般状况并测定心指数和血流动力学各参数(LVSP、±dp/dt)。(2)用酶消化的方法急性分离小鼠左心室外膜、内膜心肌细胞,采用细胞间接免疫荧光技术,通过激光共聚焦显微镜观察Kv4.2、KChIP2在心内膜、心外膜下心肌细胞上的分布。(3)分别于术后2周、5周、13周提取左心室游离壁内膜、外膜下心肌细胞膜蛋白,采用Western blot技术检测Kv4.2、KChIP2的表达量,并用GAPDH来标准化上样蛋白量。手术结扎(Band)组与同时期假手术(Sham)组对照进行比较。结果:(1)小鼠主动脉弓不完全狭窄术后,2-7周心质量指数和血流动力学各参数呈进行性上升,该时期为代偿性心肌肥厚阶段;8-13周LVSP、±dp/dt呈下降趋势,该时期为失代偿性心力衰竭阶段。(2)细胞免疫荧光观察显示:Kv4.2和KChIP2在内、外膜下心肌细胞上均有表达,且心外膜下心肌细胞Kv4.2荧光强度较内膜高,KChIP2在内、外膜上荧光强度较一致。(3)同时期Sham组内膜、外膜下心肌细胞Kv4.2表达量存在明显差异(P<0.01),心外膜下细胞表达高于心内膜(外膜/内膜=1.82),而不同时间点(2周、5周、13周)内膜及外膜间Kv4.2表达量无显著性差异(P>0.05);与同时期的Sham组相比, Band组内、外膜下心肌细胞Kv4.2表达均降低(P<0.05), 2周、5周、13周外膜下心肌细胞Kv4.2分别降低25.37%、41.33%、62.67%,内膜下心肌细胞分别降低26.32%、41.46%、66.67%;Band组2周与5周外膜下心肌细胞之间、内膜下细胞之间Kv4.2表达量无显著性差异(P>0.05),而Band 13周组内、外膜下心肌细胞Kv4.2与Band2周和5周相比呈显著性下降(P<0.05);同时期Band组内、外膜下心肌细胞Kv4.2表达量仍存在明显差异(外膜/内膜=1.91)(P<0.01)。(4)不同时间点(2周、5周、13周)Sham组内膜和外膜间KChIP2表达量没有显著性差异(P>0.05);与同时期的Sham组相比,Band 2周、5周组内、外膜下心肌细胞KChIP2表达量没有显著性差异,而Band13周组内、外膜下心肌细胞KChIP2较Sham组明显减少(P<0.05),外、内膜降幅分别为48.08%、61.11%。结论:(1)Kv4.2蛋白表达减少是造成肥厚期Ito密度降低的主要分子机制。(2)Kv4.2、KChIP2蛋白的共同下调构成了心衰时Ito下调的分子基础;KChIP2蛋白在内、外膜下心肌的非同步下调可能是心衰期病理性跨壁电异质性增大的原因。二、Calcineurin信号通路在小鼠失代偿性心衰期心室肌内膜、外膜下心肌细胞Kv4.2、KChIP2表达减少中的作用目的:本实验通过应用Calcineurin的特异性抑制剂cyclosporin A(CsA)阻断Cai2+/CaM-calcineurin-NFAT信号通路,评价该信号通路在失代偿性心衰期时Kv4.2、KChIP2表达减少中发挥的作用,为寻找可能的抗心律失常药提供实验基础。方法:在小鼠压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型上,于术后9周起皮下注射CsA,25mg/Kg,2次/天,连续两周,提取左心室游离壁内膜、外膜下心肌细胞膜蛋白, Western blot检测Kv4.2、KChIP2的表达量。实验分为:Band11w+CsA组、Band11w+Veh组,为进一步说明CsA对正常和病理状态下心肌作用的选择性,Sham11周组中设与Band11周同期的治疗组和对照组,即Sham11w+CsA组、Sham11w+Veh组。同时监测各组内、外膜下心肌细胞Calcineurin活性、心质量指数,并对各组心肌组织进行组织病理学观察。结果:(1)Sham+CsA组和Sham+Veh组间、Band+CsA组和Band+Veh组间动物外观上无明显差异。Band11w+CsA组死亡率约为8%,较同时期Band11w+Veh组无显著性差异,Sham组动物无死亡。各组小鼠的体重无显著性差异(P>0.05)。心质量指数:Band11w+CsA组同Band11w+Veh相比心指数降低(P<0.01),但没有减少到Sham11w+Veh组水平。(2)组织病理学观察:光镜下可见Sham11w+Veh、Sham11w+CsA组心肌纤维结构清晰,形态完整,排列均匀整齐,横纹清楚,细胞大小均一,仅有少量的胶原纤维;Band11w+Veh组心肌纤维染色变浅,心肌细胞体积明显增大,排列紊乱,横纹不清或消失,细胞水肿,细胞核淡染或不清楚,局部心肌溶解,胞浆疏松化;Band11w+CsA组较Band11w+Veh组心肌纤维体积增大不明显,排列较整齐,细胞水肿减轻,病变程度明显好转。(3)各组左室游离壁内膜下心肌细胞的CaN活性高于外膜(P<0.01);与Sham11w+Veh组相比,Band11w+Veh组内、外膜下心肌细胞CaN活性均显著性升高(P<0.01),内膜细胞升高幅度约为109.89%,外膜细胞升高约84.41%;CsA治疗后,Band11w+CsA组同Band11w+Veh组相比内、外膜下心肌细胞CaN活性均降低(P<0.05),且完全恢复到Sham11w+Veh水平(P>0.05)。(4)CsA治疗后,Band11w+CsA同Band11w+Veh组相比内、外膜下心肌细胞Kv4.2表达均增加(P<0.05),但没有完全恢复到Sham11w+Veh组水平;CsA对内、外膜下心肌细胞KChIP2表达无影响,同Sham11w+Veh组相比,Band11w+CsA组、Band11w+Veh组内、外膜下心肌细胞KChIP2表达均减少(P<0.05);(5)CsA对假手术组动物的一般状况、心质量指数、CaN活性及内、外膜下心肌细胞Kv4.2、KChIP2表达均无影响。结论:(1)CsA可改善心肌组织病理学形态改变程度并逆转心衰期内、外膜下心室肌细胞calcineurin活性升高。(2)calcineurin信号通路参与失代偿性心衰状态下心室内、外膜下心肌细胞Ito通道蛋白Kv4.2的下调改变,但不参与KChIP2的下调。