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本研究以中国美利奴绵羊453O11 BAC克隆片段序列为研究对象,采用噬菌斑原位杂交的方法从cDNA文库中筛选表达序列,对中国美利奴绵羊453O11 BAC克隆片段序列的组成与结构进行分析,为以后探索绵羊MHC class I区段的基因与绵羊疾病相关性,筛选优良的绵羊品种,研制有效的疫苗提供理论依据。
采用基因预测与PCR相结合的方法,从绵羊cDNA文库中获得表达基因。通过使用真核生物软件Genscan 1.0(http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html)和Fgenesh软件对453O11 BAC克隆片段序列进行基因预测,获得了15个基因的CDs序列和蛋白质序列。将预测得到的蛋白质序列与GeneBank上的Nr库进行Blastp比对,从而得到各个基因的蛋白序列相关的基因注释。以获得的CDs区序列为模板设计了四对引物Cxxy10、Cxxy11、Cxxy13和Cxxy15,采用PCR的方法从cDNA文库中扩增表达基因。四对引物中,有Cxxy10、Cxxy13和Cxxy15三对引物成功的从绵羊cDNA文库中扩增得到了表达基因。将扩增序列测序,测序结果与453O11克隆片段进行比对。结果显示,C10基因与453O11克隆序列相似性达到了94.7%,C13基因的相似性为97.3%,C15基因的相似性达到了99.2%。这就说明在该克隆上的确存在这三个基因。由此可知,采用基因预测与PCR相结合的方法,可以快速高效的从cDNA 文库中获得表达基因。
通过基因预测与PCR相结合的方法获得的表达序列片段过短,不利于基因功能的研究。所以,为了获得基因的全序列,本研究采用了噬菌斑原位杂交的方法从cDNA文库中筛选出相应基因的原克隆。以三个基因的PCR产物制备探针,进行噬菌斑原位杂交,3个基因都筛选到了阳性克隆。将筛选的阳性克隆测序,测序结果采用MegAlign软件与453O11克隆进行比对。比对结果显示,C10基因含有2个外显子,C13和C15基因分别含有3个外显子。将8个外显子在453O11克隆序列上进行定位,发现C13基因和C15基因存在外显子选择性剪接。因此,通过噬菌斑原位杂交的方法可以获得表达基因的全序列,这为后续进行基因功能的研究提供了基础。
将测序结果与GeneBank上的数据库进行核苷酸序列比对,比对结果显示C10基因和C13都与牛的朊蛋白基因和类朊蛋白基因以及牛的ABCG2基因、PKD2基因和SPP1基因具有很高的相似性,这就表明C10基因和C13基因可能与某些绵羊疾病的易感性相关。C15基因与牛的反转录酶基因有很高的相似性,表明C15基因可能与一些与反转录相关的疾病有关。因此,对这三个基因功能的研究将有助于对家畜致病机理的进一步了解,对家畜疾病防御有重要意义。
将三个基因与GeneBank上的SNPs数据库进行比对,发现C10基因存在多态性。设计引物,对11种绵羊品种的基因组DNA进行C10基因的体外扩增,将扩增序列测序,进行多重比对。比对结果显示,C10基因在该片段序列上存在着丰富的多态性。这丰富的多态性,为后面基因功能的差异性研究提供了基础。