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野生稻是栽培稻的近缘品种,其具有丰富的遗传多样性,在长期的自然选择过程中形成了抗病、抗旱、抗虫、耐冷、耐盐及细胞质雄性不育等优良特性。云南药用野生稻(Oryza officinalis Wall,2n=24)是我国3种野生稻种质资源之一,其茎杆粗壮抗倒伏,生长势强,抗多种病虫害,是栽培稻遗传改良的重要种质资源。 本实验室已构建了云南药用野生稻BIBAC文库,该文库共有53760个克隆,DNA插入片段大小为25-200 kb,覆盖率为药用野生稻基因组的5.86倍,并制备成一、二、三级混合克隆池,各混合池数量分别为3360个,140个,14个。本实验选取三级混合池中9号、10号和13号三个混合池用于转化三个水稻品种(日本晴、中花11和金南风),获得一批含有药用野生稻大片段DNA并且抗白叶枯病的转基因植株,为水稻育种提供有利的条件。主要研究结果如下: 1.提取14个三级混合池质粒,分别编号为1-14号,电击转化到农杆菌LBA4404中,统计转化后每个三级混合克隆池的农杆菌克隆数。选取9号、10号和13号农杆菌克隆30-35个,制备成相应混合大片段DNA用于转化三个水稻品种。 2.实验中将NB与MS培养基结合起来使用,可以提高水稻愈伤组织诱导率和再生率。以日本晴、中花11、金南风为转化受体材料,比较了幼穗和成熟种子诱导率,幼穗诱导率分别为92.1%,94.7%,91.5%,都高于成熟种子,且光照条件下愈伤组织长势更好。 3.混合大片段DNA通过农杆菌介导法转到日本晴、中花11和金南风。用50μg/ml潮霉素作为筛选剂,筛选6-8周;抗性愈伤组织经预分化、分化,获得309株抗性植株,转日本晴、中花11和金南风对应的抗性植株分别为116、101和92,9号、10号和13号混合池抗性植株分别为93、107和109。 4.经PCR检测、GUS组织化学染色确认了T0代43株阳性植株,日本晴、中花11、金南风转基因植株数分别为19、13和11,阳性率分别为16.3%、12.8%和11.9%。 5.通过观察T1代转基因植株表型特征,并鉴定其对白叶枯病的抗性,发现少数植株比对照组矮,多数植株抗白叶枯病能力明显提高。 本研究结果表明,通过将药用野生稻大片段DNA混合转化导入水稻基因组中,可以提高水稻植株的抗白叶枯病能力。为进一步研究和利用药用野生稻优良性状和有利基因奠定一定的基础。