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血红蛋白是由每条141个氨基酸的两条α链和每条146个氨基酸的两条β链组成的四聚体,在血液中起着运送氧分子的功能。在其与配合物的结合与解离的变构效应中,各中间反应的分子结构变化、能量变化的动力学以及作用机理对于蛋白质的结构与功能研究有重要意义。光吸收谱、光热、光声和晶体结构的X射线衍射分析等方法等能够有效地反馈结合与解离过程中的信息。本文主要介绍利用激光闪光光解法和可分辨光声量热法(PAC)对五种哺乳动物和一种高原生物的血红蛋白配合物的光解反应所进行的研究。根据实验结果得到了在光解反应不同瞬态过程中的各种动力学参量,并且从结构角度对参量进行了分析,进而阐明了血红蛋白与配体的结合和解离机制。
第一章中,首先对血红蛋白与配体结合和解离的机制作了简要介绍。然后介绍了本文所涉及的两种技术:脉冲激光闪光光解法和可分辨光声量热法,并对两种技术的基本原理和发展改况进行了简要的回顾。随后,这两种方法具体应用于五种哺乳动物的碳氧血红蛋白的光解反应研究,并从结构的角度对不同动物之间的结果差异作了分析。此外,文中阐述了研究高原动物血红蛋白的意义,并对本文工作中所用到了高原生物样品--斑头雁作了简要的介绍。最后给出本文的研究范围及目的。
第二章对五种哺乳动物的碳氧血红蛋白的光解反应进行了研究。主要是利用两种不同的方法对人、猪、牛、马、兔五种哺乳动物的碳氧血红蛋白在光解反应中的各种动力学参量进行了测量。其中,脉冲闪光光解方法得到的是各瞬态过程的时间效应和量子产率,而可分辨的光声量热法测量得到的是中间产物的能量变化和结构体积变化。本章首先对量子产率的几种传统测量方法,包括动态法、稳态法和脉冲法等作了简要介绍。然后介绍了在这些方法的基础上发展得到的脉冲激光闪光光解法。随后详细介绍了激光闪光光解法的实验系统,原理以及测量结果。另外,简单介绍了脉冲光声量热方法的发展和研究状况,并总结了这种方法的三种声源模型:指数模型,高斯模型,双极模型。文中还具体阐述了光声量热法的基本原理以及实验的装置。在实验中,采用8 ns脉冲激光作为激发光源,分别使用响应时间为几十ns的PVDF压电薄膜和中心频率1.5MHz的PZT压电陶瓷换能器作为检测设备,对多种哺乳动物的HbCO的光解反应进行了研究。通过对信号进行解卷积处理,表明两种换能器检测到的焓变和结构体积变化分别对应于光解反应中两种不同寿命的瞬态过程,即慢成对复合过程和三级弛豫过程。此外,我们还将HbCO的光解反应结果和HbO2的光解反应进行了比较。本章最后就五种动物之间参量的差异进行了讨论。通过对实验条件和样品纯度的分析,认为这种参量差异是由于不同动物的血红蛋白在结构上的差异造成的。
第三章中,主要对五种哺乳动物的血红蛋白分子结构的差异做出了分析和讨论。从分析结果得到了五种哺乳动物的HbCO光解动力学参量差异的可能原因,并推测这些物种在遗传学上可能的亲疏关系。本章首先对血红蛋白的功能、结构,与配体结合和解离时的构象变化,以及血红蛋白配合物的光解机理作了详细介绍。然后具体分析了五种动物血红蛋白不同的氨基酸序列、X射线衍射分析的晶体结构的差别以及亚基之间的盐桥和氢键的不同,并阐述了它们之间的差异对光解动力学带来的影响。
第四章中,主要研究了高原生物斑头雁及其低海拔同类(鸡、鹅)的碳氧血红蛋白和氧合血红蛋白的光解反应,定性的分析了斑头雁光解动力学的结果和分子结构之间的关系。研究表明,高原严重缺氧的环境会使其土著生物产生适应性的结构变异,在功能上表现为对配体更高的亲和力。斑头雁即为高原环境下的代表生物,它长期生活在5000米以上的高海拔地区,并且在每年两次的迁徙过程中需要飞越8000多米的喜玛拉雅山脉,因而它的血红蛋白配合物是实验研究高原生物的理想模型。从斑头雁及其低海拔同类的鲜血中提取血红蛋白,然后利用脉冲光声量热法对斑头雁及其低海拔同类的血红蛋白配合物的光解反应进行了研究,从而得到了在光解反应的不同过程中,各种血红蛋白配合物的焓变和结构体积变化。实验结果表明,高、低海拔鸟类之间的血红蛋白配合物光解动力学参量存在很大差异,这种差异远大于同样生活在低海拔的鸟类与哺乳动物之间的差异。在已有结构分析的基础上,从氨基酸序列、四级结构、血红素区域和亚基之间的作用力等多方面对高原生物斑头雁及其低海拔同类的血红蛋白进行了结构比较,进而推测导致差异产生的可能原因。
第五章中,对全文进行了总结。