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研究背景:血管增生是肿瘤发生发展中的重要特征。多种正性或负性调控因子参与肿瘤血管生成的调节,其中环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）和血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）是其中关键的正调节因子。两者不仅能促进血管内皮细胞分裂、增加肿瘤血管通透性,同时有促肿瘤细胞增殖,抗凋亡及加强肿瘤耐药等作用。环氧化酶（cyclooxygenase,COX）是人体前列腺素（PGs）合成过程中重要的限速酶,有COX-1和COX-2两种异构体。COX-1在大多数细胞中呈稳定表达,维持机体正常的生理功能;而COX-2则在各种病理过程中特别是肿瘤发生发展过程中呈诱导性表达。有研究表明,多数实体瘤病理组织中,COX-2存在过度表达,其表达水平与肿瘤的发生、进展和预后关系密切。抑制COX-2表达能有效抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡并增强肿瘤细胞对化疗药物的反应。血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）是生长因子家族中的一员。正常生理条件下,VEGF在机体组织中呈低水平表达,以旁分泌形式调节血管内皮细胞生长。恶性肿瘤细胞能大量合成并分泌VEGF,通过旁分泌方式促进肿瘤血管增生,通过自分泌方式刺激肿瘤细胞自身增殖、抑制细胞凋亡,在肿瘤的发生发展过程中发挥作用。VEGF在肿瘤中的表达受多种因素的调节,其中,COX-2能催化花生四烯酸产生代谢物PGE2正向调节VEGF的合成与分泌。在体外实验中,COX-2与VEGF的表达有明显的相关性。抑制COX-2的表达、降低PGE2水平或采用VEGF的特异性抑制剂均能有效降低VEGF的表达水平,减少内皮分裂、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡并提高肿瘤细胞对药物的敏感性。慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种造血干细胞恶性克隆性疾病。随着人们对CML发病机制的了解以及基因靶向药物——格列卫在CML治疗中的应用,CML的临床疗效已有了明显的改善,但远期效果仍不满意;对于进展和急变期慢粒患者,目前仍缺乏有力的治疗方案。因此,更加深入的揭示CML的发病机制,寻找有治疗意义的分子靶点,制定更加适合有效的治疗方案是当前迫切需要解决的问题。已有研究发现CML患者骨髓微血管密度异常增高,其白血病细胞中存在COX-2或VEGF的异常表达,但对于COX-2或VEGF在CML临床病程中表达特点的研究仍然缺乏。此外,对于两者的异常表达在CML临床中的意义、以及在CML患者骨髓单个核细胞中共表达的相关性和作用机制,国内外鲜有研究报道。本研究采用流式细胞仪技术、蛋白印迹（Western-Blot）、实时荧光定量PCR（Real time-PCR）及COX-2酶活性测定等方法从不同的角度观察了CML患者骨髓单个核细胞中COX-2的表达特点,分析COX-2的表达水平与CML患者多个临床参数之间的关系及其临床意义;定量测定血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及mRNA在CML患者骨髓单个核细胞中的表达,探讨其临床价值;研究VEGF与COX-2在CML患者骨髓单个核细胞中表达的相关性,并进一步探讨COX-2与VEGF在CML肿瘤发生发展过程中可能的相互作用机制。第一部分COX-2基因/蛋白/活性在CML患者骨髓单个核细胞中的表达分布特点及临床意义目的:从基因和蛋白水平测定COX-2在CML患者骨髓单个核细胞中表达的特点;分析COX-2表达水平与CML临床参数间的关系及其临床意义。方法:收集60例不同病程分期CML患者及15例骨髓无恶性病变的对照骨髓标本,获取骨髓中的单个核细胞,采用流式细胞术、Western-Blot、实时荧光定量PCR及COX-2酶活性测定等技术对骨髓单个核细胞内COX-2的表达进行检测,比较CML患者与对照之间及不同病期CML患者之间COX-2表达的差异;比较骨髓单个核细胞COX-2表达水平与对应的临床参数间的关系。结果:（1）与对照比较,CML患者骨髓单个核细胞中COX-2阳性细胞百分率、阳性细胞荧光强度、COX-2蛋白含量、COX-2mRNA转录拷贝数及酶生物活性均呈显著性升高（P＜0.05）;（2）不同病期CML患者骨髓单个核细胞中COX-2表达水平无显著性差异（P＞0.05）;（3）初治CML患者骨髓单个核细胞COX-2蛋白表达水平与病人年龄呈负相关（P=0.008）,与患者脾脏大小（P=0.028）、外周血白细胞数呈正相关（P=0.017）;（4）骨髓单个核细胞中COX-2高表达患者进入CML加速和急变期的时间较COX-2低表达者明显缩短（P＜0.05）。结论:CML患者骨髓单个核细胞存在COX-2异常表达,COX-2的表达水平与CML患者的肿瘤负荷相关,COX-2高表达的CML患者的慢性期缩短,更易进入加速期或急变期。第二部分VEGF蛋白及mRNA在CML患者骨髓单个核细胞中的表达状态及意义目的:观察VEGF在CML患者骨髓单个核细胞中表达的状态并分析其临床意义。方法:收集60例不同病期CML患者及15例骨髓无恶性病变的对照骨髓标本,获取骨髓中的单个核细胞,采用流式细胞术及实时荧光定量PCR测定技术对骨髓单个核细胞内VEGF蛋白及mRNA的表达进行检测,比较CML患者与对照之间及不同病期CML患者之间VEGF表达的差异;比较患者骨髓单个核细胞VEGF表达水平与其对应的临床参数间的关系。结果:（1）与对照骨髓标本比较,CML患者骨髓单个核细胞中VEGF阳性细胞百分率、阳性细胞荧光强度、mRNA转录拷贝数均明显升高（P＜0.05）;（2）不同病期CML患者骨髓单个核细胞中COX-2表达水平无显著性差异（P＞0.05）;（3）初治CML患者骨髓单个核细胞VEGF蛋白表达水平与病人年龄呈负相关、与患者脾脏大小、外周血白细胞数及骨髓粒红比呈正相关（P＜0.05）;（4）VEGF高表达患者进入CML加速或急变期的时间明显短于VEGF低表达者。结论:VEGF在不同时期CML患者骨髓中均存在异常高表达,VEGF的表达水平与CML患者的肿瘤负荷相关,高表达的VEGF对CML的预后判定有一定的临床意义。第三部分COX-2与VEGF在CML患者骨髓单个核细胞中表达的相关性及临床意义目的:观察COX-2及VEGF在不同病期CML患者骨髓单个核细胞中共表达的状态;比较COX-2与VEGF在CML中表达的相关性,揭示两者在CML疾病发生发展中的相互作用及与临床的相关性。方法:对前两部分收集并测定的患者COX-2及VEGF的数据进行进一步分析,比较不同病期CML患者骨髓单个核细胞中VEGF与COX-2蛋白及基因的共表达状态,确定两者的相关性并探讨两者在CML发病过程中的相互作用及意义。结果:不同病期CML患者均存在VEGF与COX-2高表达,各组间表达水平无明显差异;COX-2与VEGF在蛋白及基因表达水平上呈显著正相关（P＜0.05）。结论:COX-2与VEGF在不同病期的CML患者中呈共同高表达;COX-2与VEGF在CML的发病过程中可能存在着相互作用。