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目的和背景：肺癌（lungcancer）是最常见的恶性肿瘤之一，是人类因癌症而死亡的首要原因。其中以非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）最多见，约占肺癌发病总数的70-80％。对于早期NSCLC，目前首选的治疗方法是手术治疗，局部晚期NSCLC的主要治疗手段为放疗、化疗、手术治疗以及联合这些手段的综合治疗。
近年来，随着对于肿瘤细胞信号传导途径的研究不断深入，人们对肿瘤的发生、发展、复发及转移的分子机制认识越来越深入，针对肿瘤细胞信号传导通路特异性分子靶点抗肿瘤治疗新方法，具有针对肿瘤治疗特异性强的优点，效果显著，是肿瘤治疗中甚具前景的方法。在非小细胞肺癌中EGFR的研究最为深入。
EGFR存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞生长、分化的调节具有重要作用。EGFR的胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。EGFR激活后可激活许多的下游信号途径，主要有两条：一条是ras-raf-MEK-erk/MAPK途径，另一条是P13K-PKC-IKK途径。研究显示，EGFR功能异常包括蛋白突变、过表达、基因扩增、诱导产生过量的配体形成自分泌或旁分泌等。这些变异导致受体在无需配体结合的情况下自体酪氨酸激酶持续活化，从而影响细胞的增殖、凋亡，细胞周期的调控等方面，因此针对EGFR酪氨酸激酶的抗肿瘤治疗和EGFR的检测成为近年来肿瘤研究的热点。
临床上EGFR-TKI通过与ATP竞争EGFR胞内区激酶催化位点，阻断EGFR激酶活性。吉非替尼（Gefitinib，IressaTM）是一种特异性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，通过竞争性地抑制ATP与受体胞内区结合，从而抑制酪氨酸激酶活化，阻断EGFR的传导通路，达到抗肿瘤治疗的目的。
临床试验结果显示吉非替尼的疗效在不同的人群中差异较大，日本患者和欧洲患者中有效率分别为27.5％和10.4％。2004年，研究报道发现EGFR基因18、19、21外显子突变的NSCLC患者对吉非替尼的疗效较好，而这种突变多见于东亚人种、女性、非吸烟者、腺癌的患者。但在临床中却显示部分EGFR基因野生型的患者同样对吉非替尼治疗疗效较好，也有研究结果提示除了EGFR突变，EGFR-TKI治疗的疗效还与EGFR基因的拷贝数有关。总之，吉非替尼的疗效仍偏低，应用EGFR突变和EGFR基因的拷贝数对EGFR-TKI治疗的疗效和预后进行预测仍有争议。为突破这一研究瓶颈，有少数学者尝试在分子水平找到靶向调控EGFR表达的新分子，使其成为EGFR靶向联合治疗的新靶点，以提高肿瘤细胞对Gefitinib的敏感性。
目前在这方面的研究已取得了一定的进展，其中尤其以微RNA（microRNA，miRNA）的研究已成为目前肺癌领域的研究的重点和热点之一。现已证明，miRNA能抑制多种重要肿瘤相关基因的表达。如何找到能够调节EGFR的miRNA成为当前研究的一个重要突破口。为此G.J.Weiss等首先想到查找调节EGFR的miRNA，如果能够上调EGFR的表达，可能会提高EGFR-TKIs的治疗效果。为此，他们查询了TargetScan3.1数据库，结果发现miRNA-128b在EGFR3UTR上有2个预测粘附点。随后发现miRNA-128b位于染色体3P区，该区域等位基因缺失是肺癌发生过程中最频繁和最早的遗传学事件，在肺癌中等位基因缺失率为96％。检测三个肺癌细胞系（H157，H3255和H520），发现其中两个肺癌细胞系中miRNA-128b的拷贝数减少或缺失，其中在H3255细胞系中拷贝数减少或完全缺失，而在H520细胞系中为高拷贝数。IHC染色法显示：H3255中EGFR蛋白高表达，对吉非替尼敏感性较高，而H520中EGFR蛋白表达弱，对吉非替尼耐药。提示miRNA-128b拷贝数与EGFR蛋白表达及吉非替尼敏感性呈负相关，miRNA-128b可能成为EGFR联合治疗的靶点。但对于其他肺癌细胞系研究的报道尚少，且由于miRNA对EGFR信号传递影响的机制比较复杂目前并未完全明了，因此，需要进一步探讨不同细胞系中miRNA-128b对EGFR表达调控及其与Gefitinib敏感性的联系。本课题选择A549细胞，分别以microRNA128-b模拟剂和抑制剂处理，观察其对EGFRmRNA和蛋白表达水平的影响及其对EGFR靶向药物敏感性的影响。
材料和方法：
1、观察miRNA-128b在正常人支气管上皮HBE135-E6E7细胞系、人肺腺癌A549、H1650和HCC827细胞系的表达水平：采用Ambion公司的mirVanaTMmiRNAIsolationKit提取成熟miRNAs，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。采用Ambion公司的mirVanaTMqRT-PCRmiRNADetectionKit、mirVanaTMqRT-PCRPrimerSet、SuperTaqTMThermostableDNAPolymerase，采用U6-snRNA作为内对照，进行相对实时定量RT-PCR，测定HBE135-E6E7细胞、A549细胞和H1650细胞中miRNA-128b的表达水平。
2、观察miRNA-128b对A549细胞EGFRmRNA表达水平的影响：采用广州锐博生物科技公司的特异性的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改变A549细胞内miRNA-128b的活性，以β-actin基因为内参，采用相对实时定量RT-PCR法测定EGFRmRNA表达水平。
3、观察miRNA-128b对A549细胞EGFR蛋白表达水平的影响：采用广州锐博生物科技公司的特异性的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改变A549细胞内miRNA-128b的活性，以组蛋白H3为内参，采用Westemblot测定EGFR蛋白的表达水平。
4、观察miRNA-128b对A549细胞的EGFR-TKIs药物敏感性的影响：采用广州锐博生物科技公司的特异性的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改变A549细胞内miRNA-128b的活性，通过MTT法药敏试验分别检测处理前后的A549细胞株对EGFR靶向药物--吉非替尼（易瑞沙，由英国阿斯利康提供）的药物敏感性的影响。
结果：
1、采用U6-sRNA作为内对照，以HBE135-E6E7细胞的表达水平作为基准，相对实时定量RT-PCR结果表明A549、HCC827和H1650细胞系中miRNA-128b表达量均明显下调，ANOVA分析差异具有统计学意义（P<0.05）。
2、采用LivakMethod，即2-△△Ct方法判定EGFRmRNA表达水平。以2-△△Ct大于2即相差倍数大于2，为表达量相差显著。50nmol/L浓度的mimics处理的A549细胞中EGFRmRNA表达量是其对照组A549细胞中EGFRmRNA表达量的0.93倍，100nmol/L浓度的inhibitor处理的A549细胞中EGFRmRNA表达量是其对照组A549细胞中EGFRmRNA表达量的1.07倍，50nmol/L浓度的mimics和100nmol/L浓度的inhibitor处理的A549细胞中EGFRmRNA表达量与对照组A549细胞中EGFRmRNA表达量相比无显著差异。
3、分别以50nmol/L浓度的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics和以100nmol/L浓度的miR-RibonTMmiRNA-128binhibitor处理的A549细胞后，Westemblot结果显示：mimics对照组蛋白含量值为9.51±0.29，mimics组蛋白含量值为4.48±0.22，inhibitor对照组蛋白含量值为10.13±0.19，inhibitor组蛋白含量值为20.30±0.18。与对照组相比，mimics组的EGFR蛋白表达量显著减少（P<0.05）；inhibitor组的EGFR蛋白表达量显著增加（P<0.05）。
4、用MTT法检测不同浓度吉非替尼作用72h后细胞抑制率。吉非替尼对A549细胞有明显的抑制作用，并且呈剂量依赖性。MTT法药敏实验结果显示：mimics对照组IC50值为5.51±0.12μmol/L，mimics组IC50值为11.5±0.08μmol/L，inhibitor对照组IC50值为5.86±0.10μmol/L，inhibitor组IC50值为2.63±0.11μmol/L。与对照组相比，mimics组的药物敏感性显著降低（P<0.05），inhibitor组的药物敏感性显著增加（P<0.05）。
结论：
1、同正常人支气管上皮HBE135-E6E7细胞系相比，人肺腺癌A549、H1650和HCC827细胞系中miRNA-128b的表达水平显著降低。
2、miRNA-128bmimics/inhibitor对EGFRmRNA的表达水平无显著影响。
3、miRNA-128bmimics显著下调了EGFR蛋白的表达水平。miRNA-128binhibitor显著上调了EGFR蛋白的表达水平。
4、miRNA-128bmimics显著降低了吉非替尼的药物敏感性。miRNA-128binhibitor显著增加了吉非替尼的药物敏感性。