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研究背景及目的:
早期诊断率低、复发转移风险高和肝癌细胞对传统化疗药物产生抵抗等原因是导致肝癌高致死率的关键因素。Sorafenib是治疗晚期肝癌的第一个也是唯一的分子靶向治疗药物。然而，获得性耐药的出现阻止大部分患者从该药物中获益。而且，目前对于Sorafenib耐药机制的研究尚不清楚。肿瘤是异质性的细胞群体，其中包含一部分比例很小的肿瘤干细胞，这些肿瘤干细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能，且具有高致瘤性。目前研究认为肿瘤干细胞对化疗、放疗更抵抗，是肿瘤起始、复发和转移的根源。因此进一步探索肝癌Sorafenib耐药细胞和肿瘤干细胞二者之间的关联，深入理解并剖析调控Sorafenib耐药和肝癌干细胞自我更新的分子机制，针对性的开发抑制肝癌Sorafenib耐药且能特异性的靶向肝癌干细胞的治疗策略，对于肝癌的防治具有重要的意义。
本研究通过建立肝癌Sorafenib体内外耐药模型，利用人类全基因组表达谱芯片系统地检测差异基因表达情况，并结合生物信息学分析，富集到表达上调最显著的关键差异基因KIAA1199。已有研究报道，KIAA1199与多种肿瘤的疾病进展、预后不良和转移等密切相关。然而，关于KIAA1199与肿瘤细胞耐药及肿瘤干细胞的相关性目前仍未见报道。基于我们前期的研究基础和文献回顾，提出研究假设:KIAA1199参与肝癌Sorafenib耐药特征的调控和肝癌干细胞自我更新能力的维持。
研究方法:
1.通过长期诱导法建立肝癌Sorafenib体外、体内耐药模型;
2.利用人类全基因组表达谱芯片检测肝癌Sorafenib耐药模型及相应的对照模型中的基因差异性表达情况，分析并筛选参与调控Sorafenib耐药的关键差异基因;
3.Westernblotting和免疫荧光实验检测肝癌组织、细胞中相关蛋白的表达及定位情况;
4.RT-PCR检测肝癌组织、细胞中相关基因mRNA水平的表达情况;
5.Transwells实验检测耐药细胞和亲本细胞迁移和侵袭能力的改变情况;
6.HE染色分析体内小鼠脾脏-肝转移模型中不同实验组发生的转移情况;
7.通过克隆形成实验和成球实验检测干扰或过表达KIAA1199对肝癌干细胞自我更新能力的影响;
8.通过体内小鼠成瘤实验检测KIAA1199在肝癌干细胞“干性”维持中的作用及对肿瘤起始能力的影响。
研究结果:
第一节：肝癌Sorafenib体内外耐药模型建立及鉴定
建立肝癌Sorafenib体内外耐药模型，结果发现与对照细胞模型相比，肝癌Sorafenib耐药细胞株具有慢增殖的特性，而且具有与亲本细胞株一致的STR位点基因。与亲本对照模型相比，Sorafenib体内外耐药模型均表现出对Sorafenib药物处理更抵抗，高表达Sox2、Nanog和Oct4等干性相关基因，而且具有更强的克隆形成和成球等自我更新能力。
第二节：KIAA1199在肝癌Sorafenib耐药模型中显著上调
通过人类全基因组表达谱芯片分析，首次发现非综合性耳聋基因KIAA1199在肝癌Sorafenib体内外耐药模型中均显著上调;并通过westernblotting和RT-PCR技术验证该基因的表达;而且，进一步研究发现KIAA1199在Sorafenib治疗抵抗的肝癌患者中表达显著高于Sorafenib治疗敏感的肝癌患者。
第三节：KIAA1199在临床肝癌组织标本中的表达及其临床意义分析
随机选择12对肝癌及配对的癌旁组织标本，通过westernblotting技术检测KIAA1199蛋白的表达水平，结果显示KIAA1199蛋白在其中9对肝癌组织标本中表达显著高于配对的癌旁组织(9/12，75％);而且，RT-PCR结果显示KIAA1199mRNA在45例肝癌组织样本中的平均表达水平显著高于配对的癌旁组织(肝癌组织/癌旁组织=2.41倍);进一步分析KIAA1199表达与肝癌患者临床病理特征(如性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)水平、转移能力及TNM分期等)的相关性，结果显示KIAA1199高表达与肝癌患者复发、转移和TNM分期呈现明显的正相关性。
第四节：KIAA1199调控肝癌Sorafenib耐药的作用及分子机制研究
Pearson相关性分析结果显示肝癌细胞中KIAA1199的表达水平与细胞的迁移能力呈明显的正相关性。而且，与亲本细胞相比，耐药细胞Huh7Sora-R和PLC/PRF/5Sora-R体外均表现出更强的迁移和侵袭能力，进一步通过体内NOD/SCID鼠和裸鼠脾脏-肝转移模型证明接种Sora-R耐药细胞组的小鼠出现更高比例的肝脏转移。此外，研究还显示干扰KIAA1199表达可显著抑制耐药细胞的侵袭和转移能力，而且也进一步通过表达敲低加回复实验验证了该结论。而且，耐药细胞的高侵袭和转移能力与间质样细胞标志物Vimentin、Fibronectin表达显著上调，上皮样标志物E-cadherin、ZO-1和Occludin表达显著下调有关。此外，研究还发现外源添加EGF12h后即可显著诱导KIAA1199表达，表明KIAA1199是EGF诱导EMT过程的早期响应因子。而且，研究进一步表明KIAA1199上调可促进，下调可抑制EGFR，STAT3和ERRK1/2的磷酸化。随后，研究还发现敲低KIAA1199表达可显著下调EGFR表达，而且下调的EGFR表达可在回复KIAA1199表达之后成功得以恢复，该结果进一步表明KIAA1199可通过激活EGF/EGFR依赖的EMT程序介导肝癌Sorafenib耐药细胞的侵袭和转移。
第五节：KIAA1199在肝癌干细胞自我更新中的作用及分子机制研究
KIAA1199在包括Nanog、CD24、CD13和CD133等多种干性指标阳性的肝癌干细胞亚群中的表达水平均显著上调，提示KIAA1199高表达与肝癌干细胞之间存在某种联系。在Nanog启动子驱动的Nanog/GFP肝癌干细胞模型和CRISPR/Cas9/Nanog-GFP内源性Nanog标记的肝癌干细胞模型中，通过体内外实验证实干扰KIAA1199表达可显著降低NanogPos肝癌干细胞亚群的增殖能力，增强其对Sorafenib药物处理的敏感性;并显著降低其克隆形成和成球等自我更新能力以及体内肿瘤起始能力。而且，体内外实验结果还表明过表达KIAA1199可显著增强NanogNeg非肝癌干细胞亚群的自我更新能力。荧光素酶报告系统实验显示干扰或过表达KIAA1199主要影响Nanog启动子区TSS(-1000～-1500bp)的活性。进一步探索其分子机制，结果发现在肝癌干细胞中KIAA1199高表达，通过上调β-catenin表达激活Wnt信号通路，进而维持Nanog启动子的高活性并促进其表达，从而参与肝癌干细胞自我更新的调控。
研究结论:
KIAA1199是一个新的调控肝癌Sorafenib耐药、转移和肝癌干细胞自我更新的重要基因，该研究丰富了对肝癌耐药及转移的重要分子的认识，有助于为寻找特异性靶向肝癌干细胞的治疗新靶点提供理论依据。
早期诊断率低、复发转移风险高和肝癌细胞对传统化疗药物产生抵抗等原因是导致肝癌高致死率的关键因素。Sorafenib是治疗晚期肝癌的第一个也是唯一的分子靶向治疗药物。然而，获得性耐药的出现阻止大部分患者从该药物中获益。而且，目前对于Sorafenib耐药机制的研究尚不清楚。肿瘤是异质性的细胞群体，其中包含一部分比例很小的肿瘤干细胞，这些肿瘤干细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能，且具有高致瘤性。目前研究认为肿瘤干细胞对化疗、放疗更抵抗，是肿瘤起始、复发和转移的根源。因此进一步探索肝癌Sorafenib耐药细胞和肿瘤干细胞二者之间的关联，深入理解并剖析调控Sorafenib耐药和肝癌干细胞自我更新的分子机制，针对性的开发抑制肝癌Sorafenib耐药且能特异性的靶向肝癌干细胞的治疗策略，对于肝癌的防治具有重要的意义。
本研究通过建立肝癌Sorafenib体内外耐药模型，利用人类全基因组表达谱芯片系统地检测差异基因表达情况，并结合生物信息学分析，富集到表达上调最显著的关键差异基因KIAA1199。已有研究报道，KIAA1199与多种肿瘤的疾病进展、预后不良和转移等密切相关。然而，关于KIAA1199与肿瘤细胞耐药及肿瘤干细胞的相关性目前仍未见报道。基于我们前期的研究基础和文献回顾，提出研究假设:KIAA1199参与肝癌Sorafenib耐药特征的调控和肝癌干细胞自我更新能力的维持。
研究方法:
1.通过长期诱导法建立肝癌Sorafenib体外、体内耐药模型;
2.利用人类全基因组表达谱芯片检测肝癌Sorafenib耐药模型及相应的对照模型中的基因差异性表达情况，分析并筛选参与调控Sorafenib耐药的关键差异基因;
3.Westernblotting和免疫荧光实验检测肝癌组织、细胞中相关蛋白的表达及定位情况;
4.RT-PCR检测肝癌组织、细胞中相关基因mRNA水平的表达情况;
5.Transwells实验检测耐药细胞和亲本细胞迁移和侵袭能力的改变情况;
6.HE染色分析体内小鼠脾脏-肝转移模型中不同实验组发生的转移情况;
7.通过克隆形成实验和成球实验检测干扰或过表达KIAA1199对肝癌干细胞自我更新能力的影响;
8.通过体内小鼠成瘤实验检测KIAA1199在肝癌干细胞“干性”维持中的作用及对肿瘤起始能力的影响。
研究结果:
第一节：肝癌Sorafenib体内外耐药模型建立及鉴定
建立肝癌Sorafenib体内外耐药模型，结果发现与对照细胞模型相比，肝癌Sorafenib耐药细胞株具有慢增殖的特性，而且具有与亲本细胞株一致的STR位点基因。与亲本对照模型相比，Sorafenib体内外耐药模型均表现出对Sorafenib药物处理更抵抗，高表达Sox2、Nanog和Oct4等干性相关基因，而且具有更强的克隆形成和成球等自我更新能力。
第二节：KIAA1199在肝癌Sorafenib耐药模型中显著上调
通过人类全基因组表达谱芯片分析，首次发现非综合性耳聋基因KIAA1199在肝癌Sorafenib体内外耐药模型中均显著上调;并通过westernblotting和RT-PCR技术验证该基因的表达;而且，进一步研究发现KIAA1199在Sorafenib治疗抵抗的肝癌患者中表达显著高于Sorafenib治疗敏感的肝癌患者。
第三节：KIAA1199在临床肝癌组织标本中的表达及其临床意义分析
随机选择12对肝癌及配对的癌旁组织标本，通过westernblotting技术检测KIAA1199蛋白的表达水平，结果显示KIAA1199蛋白在其中9对肝癌组织标本中表达显著高于配对的癌旁组织(9/12，75％);而且，RT-PCR结果显示KIAA1199mRNA在45例肝癌组织样本中的平均表达水平显著高于配对的癌旁组织(肝癌组织/癌旁组织=2.41倍);进一步分析KIAA1199表达与肝癌患者临床病理特征(如性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)水平、转移能力及TNM分期等)的相关性，结果显示KIAA1199高表达与肝癌患者复发、转移和TNM分期呈现明显的正相关性。
第四节：KIAA1199调控肝癌Sorafenib耐药的作用及分子机制研究
Pearson相关性分析结果显示肝癌细胞中KIAA1199的表达水平与细胞的迁移能力呈明显的正相关性。而且，与亲本细胞相比，耐药细胞Huh7Sora-R和PLC/PRF/5Sora-R体外均表现出更强的迁移和侵袭能力，进一步通过体内NOD/SCID鼠和裸鼠脾脏-肝转移模型证明接种Sora-R耐药细胞组的小鼠出现更高比例的肝脏转移。此外，研究还显示干扰KIAA1199表达可显著抑制耐药细胞的侵袭和转移能力，而且也进一步通过表达敲低加回复实验验证了该结论。而且，耐药细胞的高侵袭和转移能力与间质样细胞标志物Vimentin、Fibronectin表达显著上调，上皮样标志物E-cadherin、ZO-1和Occludin表达显著下调有关。此外，研究还发现外源添加EGF12h后即可显著诱导KIAA1199表达，表明KIAA1199是EGF诱导EMT过程的早期响应因子。而且，研究进一步表明KIAA1199上调可促进，下调可抑制EGFR，STAT3和ERRK1/2的磷酸化。随后，研究还发现敲低KIAA1199表达可显著下调EGFR表达，而且下调的EGFR表达可在回复KIAA1199表达之后成功得以恢复，该结果进一步表明KIAA1199可通过激活EGF/EGFR依赖的EMT程序介导肝癌Sorafenib耐药细胞的侵袭和转移。
第五节：KIAA1199在肝癌干细胞自我更新中的作用及分子机制研究
KIAA1199在包括Nanog、CD24、CD13和CD133等多种干性指标阳性的肝癌干细胞亚群中的表达水平均显著上调，提示KIAA1199高表达与肝癌干细胞之间存在某种联系。在Nanog启动子驱动的Nanog/GFP肝癌干细胞模型和CRISPR/Cas9/Nanog-GFP内源性Nanog标记的肝癌干细胞模型中，通过体内外实验证实干扰KIAA1199表达可显著降低NanogPos肝癌干细胞亚群的增殖能力，增强其对Sorafenib药物处理的敏感性;并显著降低其克隆形成和成球等自我更新能力以及体内肿瘤起始能力。而且，体内外实验结果还表明过表达KIAA1199可显著增强NanogNeg非肝癌干细胞亚群的自我更新能力。荧光素酶报告系统实验显示干扰或过表达KIAA1199主要影响Nanog启动子区TSS(-1000～-1500bp)的活性。进一步探索其分子机制，结果发现在肝癌干细胞中KIAA1199高表达，通过上调β-catenin表达激活Wnt信号通路，进而维持Nanog启动子的高活性并促进其表达，从而参与肝癌干细胞自我更新的调控。
研究结论:
KIAA1199是一个新的调控肝癌Sorafenib耐药、转移和肝癌干细胞自我更新的重要基因，该研究丰富了对肝癌耐药及转移的重要分子的认识，有助于为寻找特异性靶向肝癌干细胞的治疗新靶点提供理论依据。