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前言： 心肌梗死是当今世界最常见的心血管事件之一，治疗时恢复血流灌注却可能因为活性氧的产生等而导致缺血再灌注损伤。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)可通过催化产生NO而促进血小板和中性粒细胞粘附聚集;调节冠状动脉血流;并在心跳节律和心肌收缩性方面发挥重要的作用。目前认为，NOS可分为三种类型:诱导型NOS(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、内皮型NOS(Endothelialnitric oxide synthase，eNOS)和神经元型NOS(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)。 NOS在缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury，IRI）中的作用目前颇有争议。大部分数据显示NOS在缺血再灌注损伤中起保护作用。通过药物抑制或者基因敲除的办法去除iNOS或者eNOS能加重心肌缺血再灌注损伤。与此相反，另一些实验却发现去除iNOS或eNOS对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。研究显示活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，如超氧阴离子和过氧亚硝酸根离子在调节心肌缺血再灌注损伤中发挥了重要作用。许多研究证明NOS激活可增加过氧亚硝酸根离子产量，过氧亚硝酸根离子是NO和超氧阴离子反应产生的，这可能是NO导致心肌缺血再灌注损伤的主要原因。有证据证明:nNOS在调节心脏心率，钙循环，钠转运和能量代谢等方面发挥关键作用，然而其在心肌缺血再灌注损伤中的作用不甚明了。离体心脏缺血再灌注实验显示，野生型和nNOS-/-小鼠心肌梗死面积无显著差异，但是在nNOS-/-组心肌梗死面积有减小趋势(33％vs30％，p＞0.05)。 有关NOS在心脏缺血预处理(Ischemic preconditioning，IP)中的作用，分为两个不同的阶段:在2-3小时的快速发展阶段，和12-24小时后，甚至72小时的延迟期，主要起保护作用。Bolli等发现NOS的两种亚型iNOS和eNOS产生的NO在IP的延迟期发挥保护作用。最近的研究也发现，在兔IP的延迟期的终末阶段，nNOS与还氧化酶-2共同作用发挥保护作用。然而，nNOS是否参与早期IP仍有争议。 尽管nNOS在调节心脏功能方面发挥重要作用，然其在心肌缺血再灌注损伤中的作用和在早期IP时对心脏的作用还不明晰。因而本研究我们主要通过观察nNOS基因敲除小鼠，nNOS抑制剂和自由基清除剂对小鼠心肌缺血再灌注损伤和缺血预处理的影响，观察nNOS在心脏缺血再灌注和缺血预处理时的作用，为深入研究nNOS在心肌缺血性疾病中的作用机制提供重要的理论和实验依据。 材料和方法： 一、实验动物与分组 12周龄nNOS KO鼠和C57BL/6小鼠(wild type，WT)由日本香川大学医学部和中国医科大学实验动物部提供。实验分为野生型假手术组(WT SHAM)，野生型缺血再灌注组(WT IR)，野生型缺血再灌注L-VNIO处理组(WT IR+L-VNIO)，野生型缺血再灌注MnTBAP处理组(WT IR+ MnTBAP)，nNOS基因敲除鼠假手术组(KO SHAM)，nNOS基因敲除鼠缺血再灌注组(KO IR)，nNOS基因敲除鼠缺血再灌注MnTBAP处理组(KO IR+ MnTBAP)，野生型缺血预处理组(WT IP)，野生型缺血预处理L-VNIO处理组(WT IP+ L-VNIO)，nNOS基因敲除鼠缺血预处理组(KO IP)。 二、实验方法 （一）小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备 小鼠心肌缺血再灌注损伤模型按照文献记载的方法并进行修改，简言之，动物由苯巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，呼吸机辅助呼吸。在手术前30min，通过颈静脉输注分别给予nNOS抑制剂，亚胺基烯丁基-L-鸟氨酸（L-VNIO，60μg/kg）和超氧化物歧化酶模拟物即过氧化物清除剂锰苯甲酸卟啉(MnTBAP，1 mg/kg)。打开左前胸，暴露心脏，用7/0尼龙丝线在左心耳下方2 mm处结扎冠状动脉左前降支，解剖显微镜下确认，结扎30 min再松开恢复再灌流3h。假手术组打开胸腔暴露心脏，而不结扎动脉。预处理组在缺血30 min实验前分别进行缺血5 min再灌注5 min共三个循环的预处理，实验前和再灌注后24 h，尾部套管法监测清醒状态下小鼠的心率和血压。 （二）心肌梗死面积的测定 在再灌注结束后，按照文献介绍的方法计算梗死面积/缺血危险区的比值。简而言之，再灌注后取下心脏，从主动脉灌注荧光聚合物溶液。在紫外光下确定缺血危险区（荧光区）。然后切片在2％2，3，5三苯基氯化氮唑(TTC)溶液中37℃孵育25分钟。梗死区为白色区域，非梗死区组织染成砖红色。通过NIH Image1.0软件测定分析缺血危险区和梗死区面积大小，并计算梗死面积/缺血危险区的比值。 （三）心肌细胞凋亡的测定 OCT包裹组织制成4μm冰冻切片并按TUNEL试剂盒要求进行染色。染色后用荧光显微镜观察结果。每个标本取三片，每片测定十个区域，每个区域计数细胞核的数量以及TUNEL阳性细胞数量，并计算TUNEL阳性细胞数量占细胞核的比值。caspase-3，8，9活性根据试剂盒说明书进行。数据用单位每μg蛋白表示。Bax，Bcl-2和Fas蛋白的表达用Western blot法进行检测。 （四）心脏脂质过氧化的测定 取左心室缺血区组织，按照文献报道的方法检测硫代巴比妥反应物质(TBARS)的水平。简而言之，组织用含0.15 mol/L KCI和0.02 mol/L Tris-HCI(pH7.4)的缓冲液制成5％（重量/体积）匀浆。匀浆液与15％三氯乙酸和0.375％硫代巴比妥酸混合。反应物中加入0.01％二叔丁基对甲酚以防止样品自氧化，混合物100℃加热15分钟。冷却后，将混合物在3500转离心20分钟，在535 nm处测定有机相的吸光度，数据用nmol每毫克组织表示。 （五）硝基酪氨酸表达水平测定 蛋白测定试剂盒测定组织蛋白含量。等量的蛋白(50 ug)进行SDS-PAGE电泳，电泳毕转移到硝酸纤维素膜上硝基酪氨酸一抗孵育，4℃过夜。 HRP-二抗孵育1小时后显色系统显色。膜脱抗体处理后再用β-actin抗体孵育。Western blot条带用NIHImage software分析灰度。 结果： 一、一般状况 在所有的野生型小鼠，体重和心脏重量无显著差异。年龄匹配的nNOS基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，体重和心脏重量较轻(p＜0.05)。在清醒的状态下，手术前后收缩压、舒张压和心率都没有显著差异。L-VNIO或MnTBAP给药预处理后收缩压，舒张压和心率与对照组相比无显著差异。 二、心肌缺血再灌注对心肌梗死面积的影响 在野生型小鼠，与WT SHAM组相比， WTIR组小鼠平均梗死面积与缺血危险区百分比显著增高(p＜0.05)。与WTIR组相比，L-VNIO预处理后比值显著降低(p＜0.05)，与WTIR组和WTIR+L-VNIO组相比，MnTBAP预处理组比值进一步降低(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，KOSHAM组平均梗死面积与缺血危险区百分比与WTSHAM组相比没有明显差异。与KOSHAM组相比，KOIR组平均梗死面积与缺血危险区百分比显著增高(p＜0.05)，与WTIR组相比，KOIR组平均梗死面积与缺血危险区百分比显著降低(p＜0.05)。与KOIR组相比，MnTBAP预处理组比值进一步降低(p＜0.05)。 三、心肌缺血再灌注对心肌细胞凋亡的影响 心肌细胞凋亡用TUNEL染色和caspase-3，8，9的活性以及凋亡蛋白Bax，Bcl-2和Fas的表达进行评价。在野生型小鼠，与WT SHAM组相比， WT IR组小鼠TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达显著增加，Bcl-2表达显著降低(p＜0.05)。与WT IR组相比，L-VNIO预处理后TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性，Bax和Fas蛋白表达显著降低，Bcl-2表达显著增加(p＜0.05)，与WT IR组和WT IR+L-VNIO组相比，MnTBAP预处理组TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达降低，Bcl-2表达显著增加(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，KOSHAM组TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax，Bcl-2和Fas的表达与WTSHAM组相比没有明显差异。与KOSHAM组相比，KOIR组TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达显著增加，Bcl-2表达显著降低(p＜0.05)，与WTIR组相比，KOIR组TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达显著降低，Bcl-2表达显著增加(p＜0.05)。与KOIR组相比，MnTBAP预处理组TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达进一步降低，Bcl-2表达显著增加(p＜0.05）。 四、心肌缺血再灌注对TBARS和酪氨酸硝基化的影响 在野生型小鼠，与WTSHAM组相比，WTIR组小鼠心脏TBARS含量和硝基酪氨酸表达明显增加(p＜0.05)。与WTIR组相比，L-VNIO和MnTBAP预处理后相应指标显著降低(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，与WT SHAM组相比，KO SHAM组心脏TBARS含量和硝基酪氨酸表达增高(p＜0.05)。KO IR组心脏TBARS含量和硝基酪氨酸表达与KO SHAM组相比无明显差异，与KOIR组相比，MnTBAP预处理组数值显著降低(p＜0.05)。 五、心肌缺血预处理对心肌梗死面积的影响 在野生型小鼠，与WTIR组相比，WTIP组小鼠平均梗死面积与缺血危险区百分比明显降低(p＜0.05)。与WT IP组相比，L-VNIO预处理后比值显著增加(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，与KOIR组相比，缺血预处理组没有降低平均梗死面积与缺血危险区百分比。 六、心肌缺血预处理对心肌细胞凋亡的影响 在野生型小鼠，与WTIR组相比，WTIP组小鼠TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达显著降低，Bcl-2表达显著增加(p＜0.05)。与WT IP组相比，L-VNIO预处理后TUNEL阳性细胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表达显著增加，Bcl-2表达显著降低(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，与KO IR组相比，缺血预处理组没有降低心肌细胞凋亡程度。 七、心肌缺血预处理对TBARS及硝基酪氨酸水平的影响 在野生型小鼠，与WTIR组相比，WTIP组小鼠TBARS含量和硝基酪氨酸表达明显降低(p＜0.05)。与WTIP组相比，L-VNIO预处理后数值显著增加(p＜0.05)。 在nNOS基因敲除鼠，与KOIR组相比，缺血预处理组没有降低TBARS含量和硝基酪氨酸表达。 结论： nNOS通过氧化/硝化应激增加加重缺血再灌注诱导的心肌损伤。nNOS可能通过抑制氧化/硝化应激机制参加了缺血预处理诱导的心肌保护作用。总之，在心脏缺血再灌注损伤和缺血预处理诱导的保护作用中nNOS发挥相反的作用。