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背景：周围神经损伤是一种很发生率较高的致残因素,周围神经一旦损伤,功能恢复十分缓慢,甚至会造成永久的功能障碍。因此,周围神经损伤后的治疗和康复研究是摆在广大医学工作者面前的一大难题,不论是病理机制还是治疗手段,都是神经科学领域的研究热点。周围神经由结缔组织和神经构成。结缔组织和神经的联系相当密切。由于终板离胞体较远,神经元发出的神经轴突一般都非常细而长。轴突之间彼此隔离而又成簇生长。神经轴突的保护主要有三层结缔组织,由内而外分别称为神经内膜、神经束膜和神经外膜。神经束膜包绕神经轴突、雪旺细胞和神经内膜而形成神经束。神经外膜包绕几条神经束而形成神经。神经损伤后机体修复的第一步则是神经元胞体的增大、尼氏小体的崩解、细胞核移至细胞周边,并启动相关蛋白合成。由于远端神经因为营养障碍甚至中断,细胞质凝结、液化,轴突脱髓鞘崩解,于是出现周围神经特征性的Wallerian退变。当Wallerian退变过程一开始,局部雪旺细胞即被激活,开始增殖。同时,在损伤部位出现大量募集的巨噬细胞。巨噬细胞主要由血液中的单核细胞趋化而来。损伤部位局部的雪旺细胞和募集的巨噬细胞将吞噬轴突和髓鞘碎片。髓鞘碎片的清除对于神经的修复十分重要,因为髓鞘含有轴突生长的抑制因子,很有可能妨碍神经再生。周围神经损伤后,雪旺细胞和巨噬细胞相互作用,对神经再生具有非常重要的意义。Wallerian退变使得远端的轴突和髓鞘退变而崩解,但雪旺细胞却很少坏死。周围神经在再生修复过程中,雪旺细胞具有非常重要的作用。研究表明,雪旺细胞不仅可以清除Wallerian退变崩解的产物和使髓鞘再形成,还能表达促进轴突生长的多种营养生长因子,并对轴突起到黏附和趋化生长的作用。神经生长因子NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一。周围神经损伤后,雪旺细胞大量增殖并分泌NGF,在损伤的局部形成高浓度的NGF而促进神经再生。Laminin是雪旺细胞基质膜的主要成分,能调控雪旺细胞的存活与功能,引导雪旺细胞从高浓度向低浓度处迁移。因此,雪旺细胞在周围神经损伤后的作用是多样性的,能在周围神经损伤后形成对神经修复再生有利的微环境,促进神经再生。另一方面,机体组织和器官时刻接受着各种不同性质的力学刺激。物理力学刺激加载于器官,可以在细胞及基因水平影响其功能。机体的细胞在承受各种力学刺激的同时,也对这些刺激做出各种生物化学的、生物力学的以及生物电生理的反应。这些反应在细胞水平对组织和器官造成各种不同的影响。实验证明,力学刺激加载于细胞能产生多种影响,包括细胞的定向分化、影响细胞增殖和迁移、增加细胞外基质的形成、改变细胞排列以及细胞形态学改变,增强细胞信号转导等等。同样地,周围神经在不同情况下承受着不同程度的力学刺激,包括周围神经在行使其正常功能时,为调节各种姿势和动作,也承受着多种力学刺激。在正常生理情况下,周围神经所受的力学刺激大概可以分为三种：挤压力、剪切力和拉伸力。由于挤压力和剪切力作用于周围神经的研究模式还不是很成熟,或是这两种作用力对于神经的作用比压力较复杂,所以通常对于拉伸应力研究得比较多。目前,拉伸应力加载在神经功能康复、神经延长术等领域研究广泛。因此,充分研究正常和损伤的神经的生物力学属性以及日常活动所引起的力学应变,有利于诊断疾病和指导物理治疗。拉伸应力加载可以平行或者垂直于神经长轴施加于神经,引起相应的纵向或者横向的压力。由纵向拉伸应力引起的神经长度改变叫做拉伸形变(strain),以延长的百分数来表示。神经在拉伸的过程中,横截面积减小。有理论模型研究发现,当神经处于拉伸应力情况下,神经外面包裹的结缔组织管或结缔组织鞘对神经的生物力学特性有十分重要的影响。结缔组织的结构改变能够影响神经的顺应性。影响神经顺应性的因素有很多,比如神经束的数量,束膜外结缔组织的横截面积等等。另外,拉伸速度、拉伸力维持的时间以及重复拉伸都能改变神经的顺应性。全身的非特异性结缔组织与神经紧密联系,相互影响,组成了一个遍布全身的“信息网络”,对机体全身功能活动进行调控。而巨噬细胞也是筋膜结缔组织中的重要细胞成分,且在周围神经损伤修复中发挥着重要作用。本实验室既往也对巨噬细胞与雪旺细胞共培养进行了相关研究,但都是在静态培养条件下进行的实验。本课题组前期研究也表明,拉伸刺激能够使筋膜结缔组织重构,并在基因水平对组织细胞产生影响。此外,有研究表明拉伸应力也能影响雪旺细胞的增殖、基因表达。然而,拉伸应力加载于与巨噬细胞培养上清液共培养的雪旺细胞会产生怎样的影响?这个疑问至今无人解答。本研究,我们采用雪旺细胞和巨噬细胞上清液共培养模型,能更好地模拟周围神经受损后的内环境,并采用周期性拉伸应力加载,在细胞增殖和迁移以及基因表达方面进行探索。目的：研究腹腔来源巨噬细胞培养上清液和周期性拉伸应力对RSC96细胞的影响,为周期性拉伸应力干预周围神经的损伤修复提供基础实验支持。方法：1.为获取巨噬细胞培养上清液,向SD大鼠腹膜腔内注射DMEM/F12培养液约10ml,约10min后抽出腹膜腔细胞悬液,离心后接种于培养板,用差速贴壁法获得腹腔来源的巨噬细胞。采用CD68和CD11b对细胞进行标记,流式细胞仪进行细胞鉴定。每隔8小时收集其培养上清液,储存以供共培养使用。2.将RSC96大鼠雪旺细胞均匀接种在六孔拉伸培养板上,分为四组：A组：RSC96(对照组),B组：共培养组,C组：拉伸组,D组：拉伸共培养组。共培养指RSC96雪旺细胞株与巨噬细胞培养上清液共培养。拉伸即周期性拉伸应力加载。周期性拉伸应力加载采用Flexcell FX-5000Tension System应力加载系统。本次实验使用圆柱形应力加载平台,提供双轴向应力,由系统自带的电脑软件对应力进行参数控制。具体设置为：正弦波,0.25Hz,最大拉伸形变为5%,每次持续时间1小时,每隔12小时拉伸一次。拉伸组一共拉伸处理5次。3.于第3天收集各组细胞,采用MTT法检测每组细胞的增殖情况。应用酶联免疫检测仪检测570nm处各孔的吸光值进行统计分析。用划痕实验进行每组细胞迁移能力测试,在处理前、后分别使用相差显微镜随机视野拍照,用ImageJ软件进行结果分析。4.用Trizol法提取总RNA,进行qPCR实验检测每组细胞所含NGF和Laminin的mRNA含量。5.用Western Blot法检测每组细胞所含NGF和Laminin蛋白的表达情况,用ImageJ软件进行灰度值分析。6.重复三次实验所得结果应用SPSS13.0软件进行统计分析,对所测得的结果进行正态性及方差齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间比较则用LSD检验,方差不齐选用Dunnett’s T3检验。检验水准为α=0.05,P<0.05认为有显著差异。结果：1.流式细胞鉴定结果显示,表达CD68和CD11b的细胞占90%,达到满意的阳性率。说明这种方法是获得腹腔巨噬细胞的简便可靠方法。2.四组细胞于第3天进行MTT检测,细胞增殖结果显示拉伸共培养组最高,拉伸组>共培养组>对照组。经SPSS13.0软件进行One-way ANO VA分析,显示组间比较有显著差异(F=28.833,P=0.000)。后续LSD检验发现处理组与对照组相比,均具有显著差异(P值分别为0.034,0.000,0.000)。说明腹腔来源的巨噬细胞培养上清液与RSC96雪旺细胞共培养,以及5%的拉伸形变的周期性拉伸应力加载对RSC96雪旺细胞都具有明显的促进增殖的作用。处理组进行两两比较,B、C两组间C组高于B组,具有显著差异(P=0.009)。这说明在5%的拉伸形变的周期性拉伸应力对RSC96雪旺细胞的增殖促进作用要优于共培养。B组和D组比较,D组高于B组,有显著差异(P=0.000)。同样说明,在腹腔巨噬细胞上清液共培养条件下,周期性拉伸应力加载能明显促进RSC96雪旺细胞的增殖。而C、D两组比较发现,D组高于C组,具有显著差异(P=0.026),说明同样在周期性拉伸应力加载条件下,共培养组增殖比单纯应力加载要明显。这两个结果也证明,周期性拉伸应力的加载和腹腔巨噬细胞上清液共培养对于RSC96雪旺细胞的增殖,两者可能具有协同效应。3.为了测试不同处理组的细胞迁移情况,我们进行了划痕实验。经过3天不同的处理之后,四组与处理前相比,空白面积显著减少(P=0.000)。B、C、D组空白区域面积值与A组相比,均显著减少(P=0.000),说明细胞迁移明显增强。One-way ANOVA进行组间比较,显示有显著差异(F=571.670,P=0.000)。进一步进行LSD检验分析发现,除了处理后的B、C两组之间相比,P=0.063(P>0.05)外,其余两两比较均有显著差异(P=0.000)。说明巨噬细胞共培养和周期性拉伸应力加载都对RSC96雪旺细胞的迁移具有促进作用,但其效应可能没有明显的差别。然而D组与B、C两组比较均有显著差异(P=0.000),D组高于B、C两组,说明这两种处理条件对雪旺细胞的迁移可能具有协同促进作用。4.经过3天不同的处理,分别用qPCR和Western blot法检测每组所含NGF的mRNA和蛋白表达。qPCR结果表明各组均比A组高,并具有显著性差异(P值分别为0.002,0.006,0.002)。同时,B、C、D三组NGF蛋白表达相比,均比A组高,也具有显著差异(P=0.000)。说明腹腔巨噬细胞培养上清液和周期性拉伸应力加载都能显著提高NGF mRNA和蛋白的表达水平。qPCR结果显示B组和C、D组之间没有显著性差异,P值分别为0.463和0.948。C组和D组之间也没有显著差异,P=0.502。Western blot检测则发现B、C、D三组之间NGF蛋白表达有显著差异(P=0.000),D组表达最高,C组高于B组,说明周期拉伸应力加载促进NGF蛋白的表达效应可能要优于共培养,这两种处理因素对RSC96细胞的NGF蛋白表达可能具有协同促进作用。5.经过3天不同的处理,分别用qPCR和Western blot法检测每组所含Laminin的mRNA和蛋白表达。qPCR结果显示B、C、D三组细胞Laminin的mRNA表达与A组相比,均比A组表达高,并具有显著差异(P值分别为0.003,0.005,0.000)。B、C两组之间比较P=0.736,两者没有显著性差异。而D组分别和B、C两组相比,有显著差异,P值分别为0.049,0.028。Western blot结果用LSD法进行各组间比较,均有显著性差异(P=0.000)。说明巨噬细胞培养上清液和周期性拉伸应力加载条件下,均能明显促进雪旺细胞Laminin的表达。巨噬细胞共培养和周期性拉伸应力对雪旺细胞Laminin表达可能具有协同促进作用。结论：1.腹腔来源的巨噬细胞培养上清液与RSC96雪旺细胞共培养,能明显促进雪旺细胞增殖和迁移,并能明显促进雪旺细胞表达NGF和Laminin。2.周期性拉伸应力加载于RSC96雪旺细胞,能能明显促进雪旺细胞增殖和迁移,并能明显促进雪旺细胞表达NGF和Laminin。3.巨噬细胞培养上清液共培养和周期性拉伸应变加载对RSC96雪旺细胞的增殖、迁移以及NGF和Laminin的表达可能具有协同促进作用。