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目的最近研究发现,正常上皮细胞通过将活细胞挤出的方式减轻增殖产生的上皮层拥挤,被挤出的细胞发生失巢凋亡。该现象启发我们,具备失巢凋亡抵抗的肿瘤细胞能否通过该方式从原发灶转移?借鉴国外研究经验,本项目通过多个实验模型和方法,研究肝癌转移过程中癌细胞挤出现象的发生和作用,并进一步研究以BVES为靶点来抑制肝癌细胞挤出,对其作用机制进行初步探讨。方法多种模型和方法观察肝癌细胞挤出现象：①将GFP标记的肝癌细胞以1：100的比例与正常L02细胞混合后接种于培养皿中,当细胞达到100%融合度时,于显微镜下观察细胞形态；②结合GM130高尔基体染色,以及激光共聚焦扫描三维重建技术,观察细胞间力和运动方向；③通过自制硅胶膜拉伸模型,提供细胞瞬时拥挤环境,观察2小时内正常L02肝细胞及Huh7和SK-Hep1肝癌细胞挤出数量；④自创大小皿倒扣模型,将长满细胞的小皿倒扣入装满培养基的大皿中,观察大皿中细胞挤出克隆数；⑤细胞三维培养模型结合激光共聚焦技术观察细胞团中细胞被挤出。qRT-PCR和免疫荧光方法检测肝癌组织样本和肝癌细胞系中BVES表达和定位,分析其与肝癌转移的关系。qRT-PCR和免疫荧光方法检测被挤出肝癌细胞中BVES表达。构建针对BVES mRNA的干扰质粒和BVES真核表达质粒,分别转染Huh7细胞和SK-Hep1细胞,获得稳定细胞株,Western blot方法检测干扰和过表达效率。通过以上研究细胞挤出的方法检测BVES表达改变后肝癌细胞挤出变化。通过裸鼠人肝癌原位移植瘤模型检测过表达BVES对肝癌转移的抑制作用,同时检测肝内原位瘤周边细胞挤出现象。免疫沉淀方法检测BVES对RhoA活性的调节作用,免疫荧光和Western blot检测BVES对ZO-1表达和定位的作用,免疫荧光观察肝癌组织和肝癌细胞系中BVES、ZO1和GEFT共定位模式,CO-IP方法检测这三种蛋白共定位,免疫荧光检测干扰或过表达BVES后GEFT细胞定位改变。基因芯片筛选BVES的下游调节分子和通路。结果在100%融合度的培养状态下,部分L02肝细胞被周围细胞所包围,受到“集体攻击”,且细胞变圆。同样,标记GFP的Huh7和SK-Hep1细胞也受到周围正常的L02细胞“排挤”。高尔基体GM130特异性染色和激光共聚焦扫描三维重建更直观地观察到肝癌细胞被L02细胞挤出现象。计数硅胶膜拉伸模型中挤出细胞,发现肝癌细胞挤出数明显多于L02细胞,且高转移的SK-Hep1细胞多于低转移潜能的Huh7细胞。大小皿倒扣模型中,大皿中挤出的细胞克隆数SK-Hep1>Huh7>LO2,与细胞侵袭潜能一致,通过GFP荧光标记发现,小皿中SK-Hep1细胞较Huh7更容易被L02细胞挤出。三维细胞培养模型中,L02细胞呈现为边界清楚的结节样结构,而在Huh7和SK-Hep-1细胞形成的细胞团周围,可见部分细胞从边缘脱离,向周围迁移。在即将脱落的细胞及其相邻细胞间,骨架蛋白F-actin染色明显增强。在肝癌组织标本中我们也发现了部分肝癌细胞挤出现象。BVES蛋白表达于细胞膜和胞浆,肝癌组织中BVES较癌旁组织明显减少,BVES表达与肝癌细胞系转移潜能呈负相关,通过细胞挤出模型发现,被挤出细胞其BVES表达减少。抑制Huh7细胞BVES表达促进细胞挤出,而在SK-Hepl细胞中过表达BVES则抑制细胞挤出。裸鼠人肝癌原位移植瘤模型中过表达BVES抑制肝癌细胞肝内外转移,在肝内原位瘤边缘,过表达BVES的肝癌细胞挤出明显减少。深入研究BVES调控肝癌细胞挤出机制,我们发现,BVES与Z01和GEFT共定位,且调控ZO1的表达和定位,影响GEFT亚细胞定位,进而抑制RhoA蛋白活性。我们还筛选出部分BVES下游信号分子和通路,对进一步的机制研究提供参考。结论细胞拥挤环境中,肝癌细胞可被正常肝细胞或癌细胞团挤出,进而发生转移。BVES可能通过多种途径和机制调节Rho蛋白活性,调控肝癌细胞挤出和转移。