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目的:脑能量代谢异常与神经退行性疾病的发生发展密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性学习记忆功能衰退为主要临床表现的神经退行性疾病。本研究前期结果表明,AD模型动物快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/prone 8,SAMP8)随增龄出现多种中枢学习记忆功能的进行性衰退,经典中药复方六味地黄汤(LW)及其活性成分复方六味地黄苷糖(LW-AFC)对SAMP8学习记忆具有明显改善作用,该作用是否与调节脑内能量代谢相关尚不明确。本研究以SAMP8为动物模型,观察LW-AFC对SAMP8增龄性学习记忆损害的改善作用,并从调节能量代谢的角度探讨了其可能的作用机制。方法:本研究选取2、6、12月龄雄性SAMP8小鼠为研究对象,同月龄的抗快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/resistance 1,SAMR1)作为对照,给予LW-AFC进行干预。药物干预后应用新异物体识别实验、Morris水迷宫实验、穿梭箱实验等研究各组小鼠学习记忆功能的变化;应用小动物氟脱氧葡萄糖正电子断层扫描([18F]fluoro-2-deoxy-d-glucose positron emission tomography,FDG-PET)技术检测小鼠脑内葡萄糖摄取水平;应用高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography,HPLC)检测小鼠海马内三磷酸腺苷(adenosine triphosphates,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphates,ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)等能量物质的增龄性变化,以检测脑内能量代谢情况;应用Western blot法检测葡萄糖转运蛋白(glucose transporters,GLUTs)及葡萄糖代谢关键酶(Hexokinase,HK)和丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)的表达情况;应用分光光度法检测HK、PDH的活性,探讨LW-AFC对能量代谢调节的可能作用机制。结果:一、LW-AFC能改善快速老化小鼠学习记忆能力选取2、6、12月龄雄性快速老化小鼠SAMP8,给予LW-AFC(1.6g/kg),以抗快速老化小鼠SAMR1作为对照。给药2个月后进行行为学实验,观察LW-AFC对SAMP8小鼠学习记忆功能的影响。结果提示,SAMP8小鼠存在显著的物体识别记忆能力、空间学习记忆能力及主动回避反应能力的损伤,LW-AFC能够显著改善SAMP8小鼠的物体识别记忆能力、空间学习记忆能力及主动回避反应能力。二、LW-AFC能改善快速老化小鼠脑内能量代谢本研究应用正电子断层扫描技术(FDG-PET)检测2、6、12月龄快速老化小鼠脑内葡萄糖摄取情况,实验结果提示,与对照组SAMR1相比,SAMP8小鼠脑内存在葡萄糖摄取增龄性降低的趋势。给予LW-AFC后,能改善SAMP8脑内葡萄糖摄取,其中在6月龄时效果最为明显。本研究应用HPLC检测2、6、12月龄快速老化小鼠海马内ATP、ADP、AMP等能量物质的含量,实验结果提示,与对照组SAMR1相比,快速老化小鼠脑内存在能量物质ATP、ADP、AMP含量的降低。给予LW-AFC后,能提高脑内能量物质的含量,改善SAMP8小鼠脑内能量供应。综上所述,LW-AFC能提高SAMP8小鼠脑内葡萄糖的摄取,改善脑内能量物质供应,可能对SAMP8小鼠脑能量代谢具有正性调节作用,但其调节机制尚需进一步研究。三、LW-AFC对快速老化小鼠脑内能量代谢及学习记忆功能影响的机制研究(一)LW-AFC能提高快速老化小鼠海马内葡萄糖转运体的表达脑内葡萄糖的转运主要依靠葡萄糖转运体进行,其中GLUT155KDa能够把葡萄糖从外周转运到脑内,而GLUT355KDa能够把葡萄糖转运到神经元细胞中,本研究主要通过对着两个转运体的研究来探讨LW-AFC对脑内葡萄糖转运的影响机制。实验结果提示,与对照组SAMR1相比,2、6、12月龄快速老化小鼠海马内葡萄糖转运体GLUT1、GLUT3均有降低的趋势,给予LW-AFC能提高GLUT1、GLUT3的表达。相关性分析结果提示,GLUT1、GLUT3的表达与快速老化小鼠的学习记忆功能成正相关。这就提示我们,SAMP8小鼠增龄性的脑内葡糖糖摄取的降低,可能与葡萄糖转运体表达密切相关。通过提高快速老化小鼠脑内葡萄糖转运体的表达,可以提高脑内小鼠的学习记忆功能。(二)LW-AFC能提高快速老化小鼠海马内能量代谢关键酶的表达及活性1.LW-AFC能提高快速老化小鼠海马内HK、PDH的表达HK、PDH是脑内葡萄糖代谢的关键酶,本研究应用蛋白印迹法检测了 2、6、12月龄各组实验小鼠海马内HK、PDH的表达,结果提示SAMP8小鼠海马内HK、PDH有增龄性的降低的趋势,给予LW-AFC能提高快速老化小鼠脑内HK、PDH的表达。相关性分析结果显示,HK、PDH的表达与小鼠学习记忆功能正相关。实验结果提示,LW-AFC可能通过提高HK、PDH的表达来提高脑内能量供应,进一步改善SAMP8小鼠学习记忆功能。2.LW-AFC提高快速老化小鼠海马内HK、PDH的活性本研究应用分光光度法检测了 2、6、12月龄快速老化小鼠海马内HK、PDH活性,实验结果提示,与同龄对照SAMR1相比,2、6、12月龄SAMP8小鼠海马内HK、PDH活性有降低的趋势,其中12月龄时酶活性显著降低,给予LW-AFC能显著提高HK、PDH活性。实验结果提示,LW-AFC对葡萄糖代谢关键酶的活性具有调节作用。相关性分析结果显示,HK、PDH的活性与小鼠学习记忆功能正相关。以上结果提示,LW-AFC可能通过提高HK、PDH的活性来改善脑内能量供应,进一步改善SAMP8小鼠学习记忆功能。上述结果提示,LW-AFC有提高SAMP8小鼠脑内葡萄糖转运体GLUT1、GLUT3的表达趋势,提高能量代谢关键酶HK、PDH的表达及活性,可能通过调节脑内葡萄糖的转运及代谢,改善脑内能量供应,进一步提高学习记忆功能。综上所述,与同龄正常对照小鼠SAMR1相比,SAMP8小鼠物体识别记忆能力、空间学习记忆能力及主动回避反应能力随增龄存在不同程度地损伤,伴随着脑内葡萄糖摄取及海马ATP等能量物质含量的降低。LW-AFC可改善SAMP8学习记忆能力,并不同程度提高SAMP8脑内葡萄糖摄取及海马能量物质的含量。进一步的机制研究表明,改善脑内葡萄糖转运体GLUT1和GLUT3的表达、提高海马能量代谢关键酶HK和PDH表达及活性可能是LW-AFC发挥上述作用的重要环节或机制。结论:通过以上实验结果,本研究得出以下结论:1.LW-AFC能够改善SAMP8小鼠的物体识别记忆能力、空间学习记忆能力和主动回避反应能力,表明口服给予LW-AFC对AD模型动物SAMP8小鼠的学习记忆功能具有明显的改善作用。2.LW-AFC有改善SAMP8小鼠脑内葡萄糖的摄取效果,提高海马内ATP等能量物质的含量,表明口服给予LW-AFC能改善AD模型动物SAMP8小鼠脑内能量代谢具有调节作用。3.LW-AFC有提高AD模型动物SAMP8小鼠海马内葡萄糖转运体GLUT1、GLUT3的表达的趋势,可能提高糖酵解及三羧酸循环过程中的关键酶HK、PDH的表达及活性,表明LW-AFC对AD模型动物SAMP8小鼠学习记忆功能及脑内能量代谢的调节可能是通过提高脑内葡萄糖转运体GLUT1和GLUT3表达、提高海马能量代谢关键酶HK和PDH表达及活性实现的。4.LW-AFC具有特殊的防治AD的优势,能够在AD发病之前,通过改善脑内能量代谢,对AD进行早期干预,并且在发病后有很好的治疗效果。因此,LW-AFC具有防治AD的潜在临床价值和良好的应用前景。