论文部分内容阅读
昆虫生殖对于其种群繁衍至关重要。目前有关昆虫生殖发育的研究主要集中于转录水平关键调控基因的鉴定和功能研究。micro RNA(miRNA)是一类重要的小分子非编码RNA,以转录后调控的方式调节基因表达。已有研究表明miRNA在昆虫生殖发育中发挥了重要作用,但是,这些研究主要集中在果蝇和蚊子等模式物种上。桔小实蝇Bactrocera dorsalis是一种高度入侵性害虫。因此,鉴定桔小实蝇中参与生殖发育的miRNA不仅可以丰富和完善昆虫生殖调控机制,而且为桔小实蝇绿色可持续治理提供了新靶标和新思路。本研究首先建立了桔小实蝇雌成虫脂肪体和卵巢组织不同生殖发育阶段的小RNA文库,从不同时期差异表达miRNAs中选取高丰度表达的3个已知miRNA,q PCR检测了其在雌成虫脂肪体和卵巢组织不同生殖发育阶段的表达模式;选取卵巢和脂肪体组织显著高表达且在不同生殖发育时期差异表达的miR-286,通过显微注射miRNA抑制剂检测了其在卵巢发育、繁殖力中的功能;通过靶基因预测、双荧光素酶验证、RNAi、拯救实验等研究明确其调控桔小实蝇雌成虫生殖发育的分子机理。1.桔小实蝇不同生殖发育阶段差异表达miRNAs鉴定及时空表达模式研究我们分别建立了桔小实蝇雌成虫卵巢和脂肪体四个生殖发育阶段(初羽化1,5,9,13 d)的小RNA文库。发现在雌成虫生殖发育期间,在卵巢和脂肪体内分别有116和84个差异表达的miRNAs。靶基因预测结果表明,参与卵子发生和脂质合成的靶基因GO分析分别占总靶标的33%和15%。在这些差异表达的miRNA中,卵巢和脂肪体内同时差异表达的miRNA有25个,选取了其中3个高丰度差异表达miRNA(miR-286,miR-317-3p和miR-2779)进行q PCR验证。q PCR验证结果与测序数据基本一致。miR-317-3p和miR-2779在脂肪体生殖发育过程中表达量显著上调;miR-286在性成熟时期脂肪体和卵巢中显著上调。组织差异表达模式显示,miR-286在卵巢和脂肪体中高表达。2.miR-286在生殖发育中的功能研究通过显微注射技术将miR-286抑制剂(Antagomir)注射至桔小实蝇雌成虫体内,检测其在生殖发育中的功能。结果显示,注射Ant-286后卵巢发育迟缓、日平均产卵量、产卵总量极显著降低;孵化率无显著变化。我们进一步通过q PCR检测后发现,抑制miR-286表达导致桔小实蝇卵黄原蛋白基因(Vitellogenin,Vg)Vg1、Vg2、卵黄原蛋白受体基因Vg R表达量均显著下调。以上结果说明,miR-286可能通过影响桔小实蝇雌虫的卵黄沉积进而影响其卵巢发育和繁殖力。3.miR-286靶基因鉴定与功能研究通过Target Scan、miRanda软件预测miR-286靶基因,选取两个软件预测的交集,共获得16个潜在靶基因,利用q PCR检测潜在靶基因与miR-286表达量的相关性,发现基因uncharacterized protein LOC105232785(UCP)、dual specificity mitogen-activated protein kinase hemipterous-like、protein escargot、GTP-binding protein2的表达量受miR-286调控并且其表达模式的趋势与miR-286相反。双荧光素酶报告实验表明UCP为miR-286的潜在靶基因。由于UCP功能未知,因此,我们通过RNAi研究了其在桔小实蝇生殖发育中的功能。结果表明,沉默UCP后,卵巢发育被抑制,产卵量显著下调。q PCR检测发现沉默UCP后,Vg1、Vg2和Vg R的表达量均显著上调,胞吞作用相关基因Endophilin B1显著下调。以上结果说明,沉默UCP后可能通过影响胞吞作用进而调节桔小实蝇雌虫的卵巢发育和繁殖力。4.ds UCP与Ant-286共注射回补实验为了明确miR-286调节靶基因UCP从而对生殖发育的调控模式,通过显微注射技术将ds Egfp/Ant-286、ds UCP/Ant-286和ds UCP/Ant-NC混合物注射至桔小实蝇雌成虫体内,结果显示,ds UCP/Ant-286与ds Egfp/Ant-286相比有拯救卵巢发育迟缓,产卵量降低等现象;通过q PCR检测发现ds UCP/Ant-286与ds Egfp/Ant-286相比Vg1、Vg2、Vg R和Endophilin B1表达量均显著上调,有显著的拯救效果。表明miR-286通过调控UCP进而影响桔小实蝇雌虫的卵黄沉积与繁殖力。综上所述,miR-286通过调控靶基因UCP表达量从而调控桔小实蝇生殖发育。本研究不仅丰富和完善了昆虫生殖发育调控机制,而且为桔小实蝇绿色防控策略奠定了理论基础。