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胰管胆管合流异常（pancreaticobiliary maljunction，PBM）目前认为是由于胆管和胰管在十二指肠壁外提早汇合，共同管过长致使十二指肠乳头部Oddi括约肌不能支配和调节汇合部而引起胰胆汇合部流体力学异常。由于存在胆汁胰液的反流，而胆汁里含有多种胰酶激活物，长时间的胰液和胆汁混合，各种胰酶如磷脂酶A2 和胰蛋白酶在胆道被激活，具有很强的破坏、腐蚀和消化作用，引起胆管壁慢性炎症、胆道结石，致使胆管上皮紧密连接受到损坏，其屏障功能下降，进而引起胆管上皮恶性转化的几率增加，给此类病人的生活质量和健康带来严重挑战。我们拟利用基因芯片技术筛选胰胆管合流异常患儿差异表达基因，并通过qRT-PCR验证，为PBM患儿早期诊断生物标志物的寻找提供新的思路；此外，大量证据表明，许多胆汁淤积性疾病如肝硬化、胆道闭锁都与紧密连接破坏和胆道屏障功能障碍相关。然而，目前国内关于PBM 患儿胆道上皮紧密连接破坏相关的研究报道很少；胆道疾病发生过程中的一个重要环节被认为是胆道上皮屏障的破坏，胆道粘膜屏障功能的结构基础源于胆道上皮细胞间的紧密连接，胆管上皮的紧密连接维持胆管上皮细胞极性和胆汁在管腔内单向流动，而紧密连接完整性的丧失导致胆管结构变形。因此，我们通过研究紧密连接相关蛋白在 PBM 患者胆道上皮表达与分布的变化，为今后进一步研究 PBM 患儿胆道粘膜紧密连接损坏的演变提供依据。 （一）胰胆管合流异常患儿差异表达基因的研究 目的：利用人类全基因组表达谱芯片技术分析胰胆管合流异常患儿和健康儿童基因表达谱差异，筛选出胰管胆管合流异常相关基因。 方法：采用Trizol法提取5例胰胆管合流异常患儿和3例健康对照外周血单核细胞总RNA并纯化，逆转录合成cDNA，应用cDNA微阵列技术对胰胆管合流异常患儿和正常儿童的基因表达情况进行检测和比较，遴选差别表达基因，对差别表达基因进行GO分析和 Pathway分析，并对Tight-junction信号通路中差异表达基因EPB41L2、GNAI3、MPP5、MRAS和Jak-STAT信号通路中差异表达基因IL13、IL4进行qRT-PCR验证。 结果：筛选出胰胆管合流异常患儿差异表达基因共4949个（Cut off=2.0），其中上调2628个，下调2321个。聚类图显示PBM患儿与正常儿童有明显不同的表达谱；GO 分析在生物过程和分子功能上存在差异较大；pathway 分析显示上调的通路主要有Tight-juntion信号通路、Jak-STAT信号通路等；qRT-PCR验证EPB41L2，GNAI3，MPP5，MRAS，IL13，IL4基因的上调倍数分别为1.684211±0.26885925，2.742857±0.833693，2.742857±0.833693，1.8125±0.269251，2±0.351104，1.818182±0.298205，1.761905±0.321678，表达趋势与芯片结果一致。 结论：1.在PBM患儿，基因EPB41L2，GNAI3，MPP5，MRAS，IL13，IL4表达上调2. Tight-junction信号通路可能参与PBM患儿上皮屏障的破坏过程；3. Jak-STAT信号通路可能参与了PBM患儿胆道黏膜的慢性炎症过程。 （二）紧密连接及相关蛋白在胰胆管合流异常患儿胆道上皮中的表达改变及意义 目的：探讨Occludin、Claudin-2、ZO-1和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）在胰胆管合流异常患儿胆道上皮中的表达情况。 方法：收集15例PBM患儿胆管组织标本为实验组，采用Western-Blot和免疫组织化学染色技术检测Occludin、Claudin-2、ZO-1和肌球蛋白轻链激酶的表达情况，10例正常胆管组织为对照；采用Spearman相关分析法分析肌球蛋白轻链激酶和Claudin-2、Occludin、ZO-1表达之间的关系。 结果：1.Western-blot显示Occludin、Claudin-2在胰胆管合流异常患儿胆道上皮中表达降低（P＜0.01），ZO-1和肌球蛋白轻链激酶表达升高（P＜0.01）；2.免疫组织化学显示Occludin、Claudin-2，ZO-1主要在细胞膜和细胞质上表达，MLCK主要在胞质中表达；表达趋势与Western-blot结果一致。3.Spearman相关性分析表明，MLCK的表达与Occludin的表达呈强负相关（rs= ?0.597，P=0.002）；MLCK的表达与Claudin-2的表达呈中等负相关（rs= ?0.457，P=0.022）；MLCK的表达与ZO-1的表达呈强正相关（rs=0.843，P=0.000）。 结论：PBM患儿胆道屏障破坏可能导致胆道上皮中紧密连接蛋白Claudin-2，Occludin表达下调，ZO-1表达上调；MLCK可能参与PBM患儿胆道上皮屏障的破坏过程。