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研究目的:肝癌是一种发病率与死亡率均很高的恶性肿瘤,在我们国家其发病率更是居全球之首。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最主要的组织学亚型,其发病率正在逐年增加。对于绝大部分不适合手术的HCC患者而言,采用化疗药物进行姑息治疗是目前临床上唯一的治疗策略。但是临床上除索拉非尼外缺乏公认的有效药物,对于索拉非尼不耐受或者不敏感的晚期HCC病人而言,目前临床上多寻求于其他化疗药物的联合应用。本课题前期研究发现新型EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼与传统细胞毒类化疗药物伊立替康的活性代谢物SN-38在HCC细胞株上展现了很好的合用效果,基于此,本课题拟进一步探究伊立替康与吉非替尼联合应用治疗肝癌的药效学及相关机制,为临床用药与研究提供一定的实验依据。研究方法:1.研究伊立替康与吉非替尼联合应用的体内外抗肝癌效果:采用SRB比色法与克隆形成实验检测SN-38与吉非替尼单用/合用对于HCC细胞(Hep G-2、BEL-7402)的增殖抑制作用;在Hep G-2裸小鼠移植瘤模型上考察伊立替康与吉非替尼单用/合用对于肿瘤的抑制作用。2.检测两药合用时HCC细胞的凋亡水平:利用Annexin-V(膜联蛋白-V)-PI(碘化丙啶)双染法结合流式细胞术检测SN-38与吉非替尼单用/合用后HCC细胞(Hep G-2、BEL-7402)凋亡率;利用Western Blot法检测HCC细胞凋亡蛋白的表达水平;利用DAPI染色观察HCC细胞凋亡后的核固缩与凋亡小体的形成。3.明确两药合用效果与肝癌细胞DNA损伤应答之间的关系:利用Western Blot法检测SN-38与吉非替尼单用/合用后HCC细胞(Hep G-2、BEL-7402)DNA损伤应答相关蛋白的表达水平;利用免疫荧光法观察DNA双链损伤标记物γ-H2AX于细胞核内的聚集情况;利用蛋白合成抑制剂CHX、溶酶体抑制剂氯喹与蛋白酶体抑制剂MG132结合Western Blot法研究Rad51的降解与两药合用疗效增强之间的关系。研究结果:1.伊立替康与吉非替尼合用在肝癌治疗中的药效学研究:(1)在体外,SN-38与Gefitinib于HCC细胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用48h,SRB法检测结果表明到两药合用能够显著抑制HCC细胞增殖,合用指数(CI)也显示两药合用有协同作用,另外克隆形成实验进一步验证了两药合用能够增加对HCC细胞增殖的抑制作用。(2)在体内,通过接种Hep G-2建立裸小鼠移植瘤模型对伊立替康与吉非替尼两药合用的体内抗肝癌效果进行考察,结果显示两药合用(Irinotecan 1mg/kg,Gefitinib 100mg/kg)比两药各自单独使用更加能够抑制肿瘤的生长,具有协同治疗作用。2.伊立替康与吉非替尼合用在肝癌治疗中发挥协同作用的机制研究:(1)吉非替尼增强SN-38诱导HCC细胞发生Caspase依赖的细胞凋亡:(1)SN-38与吉非替尼于HCC细胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用36h,Annexin-V(膜联蛋白-V)-PI(碘化丙啶)双染法结合流式细胞术结果显示两药合用能够明显促进细胞凋亡;(2)DAPI染色结果显示两药合用后细胞发生核固缩、凋亡小体增加,呈现明显的细胞凋亡状态;(3)Western Blot结果显示,两药合用能够明显增加凋亡相关蛋白表达水平,而在泛Caspase抑制剂作用后,细胞凋亡水平得到了显著回降,提示两药合用促进细胞凋亡是Caspase依赖的。(2)在HCC细胞上SN-38与吉非替尼联合应用能导致明显的DNA损伤:(1)免疫荧光结果显示两药合用6h后DNA损伤标志γ-H2AX于细胞核内聚集,提示DNA损伤的增加;(2)Western Blot结果显示两药合用6h后γ-H2AX与另一DNA损伤标志蛋白p53的表达水平均有上升,进一步明确了DNA损伤的加剧。(3)两药合用能够通过细胞同源重组修复的缺陷而导致DNA损伤的积累:(1)Western Blot结果显示两药合用6h后细胞DNA损伤修复相关蛋白CHK1与CHK2的磷酸化水平上升,表明DNA损伤修复的启动,而另一下游DNA损伤修复相关蛋白Rad51的表达水平有所下降;(2)两药分别合用12h/24h后,吉非替尼与合用组的Rad51表达水平进一步下降,提示吉非替尼可能通过抑制Rad51而阻碍细胞同源重组修复而导致SN-38诱导的DNA损伤的积累,从而增加了SN-38的药效。(4)泛素蛋白酶体通路与吉非替尼诱导的Rad51表达抑制相关:(1)Western Blot结果显示吉非替尼与Rad51蛋白水平的下降存在量效/时效关系;(2)蛋白合成抑制剂CHX与溶酶体抑制剂氯喹并不能逆转吉非替尼作用下的Rad51表达水平的下降,而蛋白酶体抑制剂MG132则能逆转此现象,提示吉非替尼诱导的Rad51表达水平的降低可能与泛素蛋白酶体通路相关。研究结论:(1)伊立替康与吉非替尼合用能够抑制HCC细胞株的增殖和肿瘤的生长,协同发挥抗肝癌作用。(2)吉非替尼通过引发蛋白酶体依赖的Rad51下调造成细胞同源重组修复阻碍,导致DNA损伤加剧进而诱导HCC细胞发生Caspase依赖的细胞凋亡,从而增强伊立替康的体内外抗肝癌效果。