论文部分内容阅读
目的本研究通过酒精灌胃的方法建立酒精性肝病大鼠模型,探讨肝细胞凋亡相关基因及因素在酒精性肝病中的表达,为酒精性肝病发病机制的研究提供实验与理论依据。方法1.酒精性肝病动物模型的建立与分组:Wistar大鼠随机分为两组,模型组给予40%酒精8g/kg/d,分二次灌胃,共12周;对照组给予等量的生理盐水灌胃。实验第8、12周末处死动物,左心室采血离心保存待测血清指标。取肝组织一部分经10%中性福尔马林固定待做病理、凋亡及免疫组织化学检测;一部分肝组织经2.5%戊二醛固定待做电镜检查;另一部分肝组织-70℃液氮保存待做PCR法检测。2.应用光镜（HE染色）和电镜分别观察肝组织病理变化和肝细胞超微结构变化,用TUNEL法检测肝细胞凋亡,用全自动生化仪分别检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量,用免疫组化染色方法（采用SABC法）分别观察肝组织内的半胱天冬酶—3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤—2基因（Bcl-2）和核转录因子KB（NF-kB）表达,用硫代巴比妥酸法（TBA法）和黄嘌呤氧化酶法分别测定血清丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力,用放射免疫分析法和免疫组化染色法分别观察血清和肝组织的肿瘤坏死因子—α（TNF-α）的水平,用PCR法测定肝细胞色素P450 2E1的表达。结果1.模型组与对照组比较血清ALT（116.12±14.30 vs 43.56±7.89）IU/L值和AST（248.83±20.25 vs 84.67±12.67）IU/L值明显升高,ALT/AST比值＞2,有统计学意义（P＜0.05）。2.HE染色组织切片光镜下模型组与对照组比较,肝细胞明显肿胀,可见大小不等的脂肪空泡,部分处可见“嗜酸性小体”和点状、灶壮坏死,周围有炎性细胞浸润,肝组织内胶原纤维轻度增生;电镜下模型组与对照组比较肝细胞线粒体明显肿胀,嵴显示不清,部分呈空泡样变性,肝细胞内质网旺盛,可见肝细胞、肝窦内皮细胞凋亡。3.凋亡的肝细胞主要分布在肝组织中点状、灶状和碎屑样坏死区及其周围,模型组（6.2±1.7%）肝细胞凋亡指数明显高于对照组（1.7±0.8%）,且随造模时间延长模型组细胞凋亡指数明显增加,有显著性差异（P＜0.05）。4.Caspase-3、Bcl-2和NF-B阳性细胞主要分布在中央静脉及肝细胞坏死灶周围,模型组Caspase-3、Bcl-2、NF-kB基因表达强度明显高于对照组（P＜0.05）,且Bcl-2与NF-kB表达之间呈正相关(r=0.576,P＜0.01>。5.与对照组相比模型组血清MDA（15.72±2.06 vs 41.53±7.43）nmol/ml含量明显升高,而血清SOD（636.82±138.60 vs 353.12±61.02）u/ml活力明显下降,两组间均有统计学意义（P＜0.05）,且MDA与SOD呈负相关（r=-0.5818,P＜0.05）。6.肝细胞凋亡指数与血清MDA呈正相关,与血清SOD呈负相关(rMDA=0.6437,rSOD=-0.5115,P＜0.05)。7.与对照组相比模型组血清TNF-α（745.6±174.8 vs 1236.4±283.5）ng/L含量明显升高,两组间有统计学意义（P＜0.05）,且肝细胞凋亡指数呈正相关（r=0.8358,P＜0.05）。8.血清TNF-α与血清MDA呈正相关、与血清SOD呈负相关(rMDA=0.4654,rSOD=-0.38 17,P＜0.05)。9.模型组肝组织TNF-α表达强度明显高于对照组,且随造模时间延长表达强度增强,有显著性差异（P＜0.05）。10.肝组织TNF-α的表达与Caspase-3的表达呈正相关（r=0.648,P＜0.01）,与NF-kB的表达呈正相关(r=0.678,P＜0.01>。11.模型组肝组织CYP2E1的B基因（c1/c2）,C基因（c2/c2）表达强度明显高于对照组,其差异有统计学意义（P＜0.05）,且与对照组相比c1基因频率（53.4%）明显降低,c2基因频率（46.7%）明显升高,其差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1.Caspase-3、Bcl-2、NF-kB参与酒精性肝病的肝细胞凋亡,其中NF-kB作为一种抑制凋亡的转录因子,通过对Bcl-2一类的下游抗凋亡基因表达的调节而发挥作用。2.TNF-α和脂质过氧化损伤在酒精性肝病的肝细胞凋亡过程中起一定作用,并且TNF-α通过其受体介导Caspase-3活化参与酒精性肝病的肝细胞凋亡。3.TNF-α活化NF-kB而共同参与酒精性肝病的肝细胞凋亡。4.CYP2E1基因PstI及RsaI RFLPs参与酒精性肝病的肝细胞凋亡,其中c2基因在肝细胞凋亡中可能起决定作用。