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近年来,拟除虫菊酯农药逐渐取代高毒类有机磷农药和长效残留有机氯农药,广泛应用于农作物害虫和室内卫生害虫的防治。由于菊酯的大量使用而导致的农药残留问题日趋严重,对生态环境的破坏和人体健康的影响不容小视,已经引起人们的广泛关注。而生物修复因其经济安全,方便高效的优点成为消除菊酯农药污染的重要手段。本论文将对菊酯降解菌株的分离鉴定和生物学特性、降解特性和代谢途径、水解酶的纯化等方面进行研究,为菊酯类农药微生物降解理论研究和实际应用提供科学依据。采用富集培养方式从菊酯农药厂生产废水生物处理系统中分离到甲氰菊酯降解菌JZ-2,经形态、生理生化和16S rDNA基因序列系统分析,将其初步鉴定为鞘酯菌属(Sphingobium sp.),这是首次从鞘酯菌属中分离获得能够降解菊酯的菌株。菌株JZ-2与Sphingobium cloacae JCM 10874T和Sphingobium ummariense CCM7431T同源性最高,分别为98.3%和97.1%,与其余的模式菌株同源性也在94.8-96.9%之间。菌株JZ-2主要的非极性脂肪酸是18：1ω7c,主要的2-羟基脂肪酸是14：02-OH,主要的醌是Q-10,所含极性酯主要为：双磷脂酰甘油、磷脂酰单甲基乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和鞘糖脂。主要的多胺是亚精胺,G+C含量为63.8±0.8mol%。菌株JZ-2和Sphingobium cloacae JCM 10874T, Sphingobium ummariense CCM7431T的DNA-DNA杂交同源性分别为34%和23%。通过对拟除虫菊酯降解菌JZ-2表型(生理生化特征比较、多胺、极性酯成分、醌组分)、基因型(G+C mol%含量以及DNA-DNA杂交分析)和系统发育特征分析,菌株JZ-2鉴定为鞘酯菌属中的一个新种,命名为范氏鞘酯菌Sphingobium faniae sp. nov. (=CGMCC 1.7749T=DSM21829T)。该菌部分生物学特性如下：该菌株在pH7.0生长最好,最适生长温度为30℃,装液量20 m1/150 ml时,生长量最大,随着装液量的增加生长呈下降趋势。在10～15 g··l--1的盐浓度范围生长较好,以葡萄糖为碳源、以有机氮为氮源的培养基中生长较好。对氨苄青霉素、链霉素有抗性。范氏鞘酯菌JZ-2不仅能够很好地降解甲氰菊酯,还能降解氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯和联苯菊酯等多种拟除虫菊酯类杀虫剂,降解速率顺序为：甲氰菊酯>氯菊酯>氯氰菊酯>氰戊菊酯>溴氰菊酯>联苯菊酯；菊酯分子结构中氰基、二氯乙烯基的引入对菊酯的降解效率影响不大,而联苯基、二溴乙烯基、氯苯基和2-氯-3,3,3-三氟甲基-乙烯基的引入显著降低菌株对菊酯的降解效率。对菌株JZ-2的降解特性研究结果显示,降解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃,接种量在2%以下时,甲氰菊酯的降解速率与初始接种量呈正相关,在浓度为20～100 mg.1-1范围内,甲氰菊酯能迅速降解。基于菊酯降解菌(酶)可以在含有菊酯的琼脂平板上因降解菊酯而产生水解圈而建立了一种新的定性检测菊酯降解的方法。通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶层析和PAGE切胶回收电洗脱等纯化手段,将菊酯水解酶(PytH)纯化了108.5倍,最终得率为10.2%。该水解酶是单体酶,分子量大小约31±1 kDa,等电点4.8,水解甲氰菊酯的最适反应温度为40℃,最适pH值为7.5,在10℃-50℃温度范围内比较稳定。Ag+, Cu2+, Hg2+, Ni2+, Zn2+,甲基对硫磷和对氯汞苯甲酸强烈抑制水解酶的酶活。苯甲磺酰氟完全抑制水解酶的酶活,说明该酶可能是丝氨酸酯酶。PytH的最适底物是甲氰菊酯,酶的比活达到42.31 U.mg"1,还能水解氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和联苯菊酯等。该酶的最大降解速率Vmax为7.536 nmol·min-1,米氏常数Km为0.05 nmol·ml-1。经艾德曼降解反应测得NH2-氨基酸十五个氨基酸残基(NH2-Met-Thr-Val-Thr-Asp-Ile-Ile-Leu-Ile-His-Gly-Gla-Leu-Asn-Arg)。该序列与已报道菊酯水解酶EstP、Pye3和来源于哺乳动物和昆虫的菊酯水解酯酶均无同源性。由于在上述诸方面与已报道菊酯水解酶特性有很多不同,PytH是一个新的菊酯水解酯酶。菌株JZ-2降解甲氰菊酯的可能代谢途径如下：JZ-2首先将甲氰菊酯水解为甲氰菊酸和3-苯氧基苯甲醛,后者可被进一步氧化为3-苯氧基苯甲酸,3-苯氧基苯甲酸经3-苯氧基苯甲酸双加氧酶生成原儿茶酸和苯酚,原儿茶酸经3,4-双加氧酶而开环降解,苯酚先被氧化形成邻苯二酚,然后通过邻位途径开环降解。初步研究了Sphingobium faniae JZ-2在实验室模拟条件下对水体中的低浓度甲氰菊酯的降解情况。当补加无机盐时,该菌株72 h内能够有效降解50μg·1-1池塘水体和污泥中的甲氰菊酯,解除甲氰菊酯对水生生物的毒害。这说明菌株JZ-2在降解水体中的菊酯残留方面有很大潜力。