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背景和目的牙周炎是由多种因素相关的慢性感染性疾病,常引发牙周支持组织的炎性破坏,进而导致牙丧失,对患者的咀嚼功能、美观及身心健康造成了严重影响。牙周病治疗的最终目标是在控制感染的基础上重建牙周组织。随着干细胞、组织工程技术日新月异的发展与应用,为牙周炎的治疗提供了更为有效的方法。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周组织再生的主要功能细胞,亦是牙周组织工程的主要种子细胞。研究发现PDLSCs具有自我更新、多向分化等能力,可分化为牙骨质、牙槽骨和牙周膜样组织,并因其免疫原性低,植入机体后性能稳定,对受植区环境适应能力强,对机体损伤小等特点,成为牙周组织再生良好的种子细胞。PDLSCs的再生功能受牙周不同环境因素的影响,这种环境因素包括细胞、细胞外基质、细胞因子、细胞表面分子、信号分子、细胞间相互作用、炎症因子等因素。首先,牙周组织维持其生理及代谢功能源于多种细胞间的相互作用,而牙槽骨的新生和吸收由成骨细胞和破骨细胞共同完成。作为种子细胞的PDLSCs必然发生与成骨细胞或破骨细胞的相互影响。国内外许多学者认为成骨细胞能够通过分泌某些生长因子促进间充质干细胞的成骨分化。本课题组前期研究亦显示,PDLSCs能促进成骨细胞的成骨分化。然而,成骨细胞对PDLSCs成骨分化的影响尚不明确。此外,PDLSCs的功能很可能受到炎性因子的影响。TNF-α是引起牙周组织破坏的最重要的炎性因子之一。研究表明,TNF-α对PDLSCs和成骨细胞的成骨分化有抑制作用,因此,探索针对TNF-a的拮抗措施,有利于促进炎性环境下的牙周再生。颗粒蛋白前体(progrαnulin,PGRN)是一种具有多重作用的生长因子,有研究表明:PGRN能直接促进间充质干细胞的成骨分化。但PGRN能否逆转TNF-α对PDLSCs成骨分化的抑制作用以及能否促进PDLSCs的成骨分化尚未见报道。本研究旨在观察间接共培养条件下成骨细胞对PDLSCs成骨分化作用的影响;在进一步明确TNF-α对PDLSCs成骨向分化影响的基础上,探讨PGRN逆转TNF-α对PDLSCs成骨分化的抑制作用及PGRN对PDLSCs成骨向分化的直接促进作用,为深入理解牙周再生机制和完善牙周组织工程策略提供实验依据,为临床上牙周炎的治疗提供了新的方法和思路。材料与方法1.PDLSCs的分离培养与鉴定1.1 PDLSCs的分离培养收集临床因正畸需要而拔除的健康前磨牙或由于阻生而拔除的无龋病且牙周健康的第三磨牙,刮取根中1/3的牙周膜,采用组织块及酶消化法分离培养PDLSCs,有限稀释克隆法纯化PDLSCs,取活性良好的细胞用于后续实验。1.2 PDLSCs的多向分化在体外以10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/L维生素C诱导PDLSCs向成骨细胞分化,28 d后,茜素红染色法检测矿化结节的形成;以1 μM地塞米松,10μg/ml胰岛素,0.5mMIBMX,0.2mM吲哚美辛分别诱导PDLSCs向脂肪细胞分化,21 d后,油红O(Oil Red O)染色检测脂肪滴的形成。2.成骨细胞对PDLSCs成骨分化的影响及机制利用Transwell系统,将PDLSCs置于其下室,不同比例的成骨前体细胞(MC3T3-E1)及其对照细胞牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs)置于上室,成骨诱导培养基下共培养。检测PDLSCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase activity,ALP)活性及碱性磷酸酶(ALP)、runt 相关转录因子-2(runt-related transcription factor-2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA及蛋白的表达水平;牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)、牙骨质蛋白-23(cementum protein 23,CP-23)mRNA表达水平;观察矿化结节的形成情况,以此说明成骨细胞对PDLSCs成骨分化和矿化的影响。用ELISA评价HGFs与MC3T3-E1细胞分泌的BMP-2,以此反映成骨细胞促进PDLSCs成骨分化和矿化的机制。3.TNF-α对PDLSCs成骨分化作用的影响将10ng/mlTNF-α作用于PDLSCs,分别于7、14d检测PDLSCs的ALP活性,于7、14、21 d检测成骨指标ALP、Runx2、OPN的mRNA及蛋白的表达水平。4.PGRN 对正常和炎性环境下PDLSCs成骨分化作用的影响检测不同浓度 PGRN 对 PDLSCs 的增殖(cell-counting kit-8,CCK8)、ALP活性、成骨分化相关标志物mRNA表达水平的影响,筛选出PGRN促进成骨分化的最佳浓度;然后,将实验分为四组:A组:对照组:单独培养PDLSCs;B 组:10ng/mlTNF-α;C 组:25 ng/mlPGRN;D 组:10 ng/ml TNF-α+ 25 ng/ml PGRN。检测培养不同时间点PDLSCs的ALP活性;ALP、Runx2和OPN的mRNA及蛋白水平的表达;同时,于21 d进行矿化结节茜素红染色和钙含量测定。结果1.PDLSCs的分离培养及鉴定成功分离培养出状态良好的PDLSCs。PDLSCs成骨诱导4 w后用茜素红染色,镜下观察可清楚地看到大小不同的红色钙结节形成;PDLSCs成脂诱导2 w后,油红O染色可见清晰红染的脂肪小滴形成。2.MC3T3-E1细胞促进PDLSCs的成骨分化在7、14 d时,PDLSCs与MC3T3-E1细胞各共培养组(OB共培养组)的ALP活性显著高于对照组及与HGFs共培养组(pp<0.05),其中,7d时的PIM2组和14d时的P1M1、P1M2组ALP活性表达最高。在3、7和14 d时,MC3T3-E1细胞培养液中分泌的BMP-2呈时间依赖性显著高于 HGFs 分泌的 BMP-2(pp<0.05)。在多数的OB共培养组中,ALP、Runx2、OPN的mRNA表达水平明显上调,其中,7、21 d的P1M2组及14d的P1M1组的ALPmRNA表达水平最高(pp<0.05);P1M2组的Runx2mRNA表达水平最高;P1M2、P2M1组的OPNmRNA表达水平高于各实验组(p<0.05)。CAPmRNA表达在7、14 d的P1M1、P1M2组,21 d除了P1M4的所有OB共培养组显著增强(pp<0.05);在多数的OB共培养组中,CP-23 mRNA表达水平明显上调,其中,P1M2组的表达最高。7 d时,PDLSCs与MC3T3-E1细胞共培养组的ALP、Runx2、OPN的mRNA表达水平显著高于与HGFs共培养组(pp<0.05)。ALP的蛋白表达高峰出现在7、14d的P1M2组及21 d的P1M1、P1M2组(p<0.05);Runx2的蛋白表达高峰出现在7d的P1M2、P2M1组和21d的P1M1组(p<0.05);OPN的蛋白表达高峰均在三个时间点的P1M2组(p<0.05)。7d时,PDLSCs与MC3T3-E1细胞共培养组的ALP、Runx2、OPN的蛋白表达及矿化结节的形成均显著高于与HGFs共培养组(p<0.05)。3.TNF-α抑制PDLSCs的成骨分化TNF-α浓度为10ng/ml,在7、14d时,ALP活性显著低于对照组;ALP、Runx2、OPN的mRNA及蛋白的表达水平显著低于对照组(p<0.05)。4.PGRN促进PDLSCs的成骨分化4.1适当浓度的PGRN促进PDLSCs的增殖及成骨分化培养24h后,与对照组相比,PGRN浓度为25,50ng/ml时,PDLSCs的增殖作用明显(p<0.05);48和72h,PGRN浓度为5,25ng/ml时,PDLSCs的增殖作用显著高于对照组,且在25 ng/ml时促增殖作用最大(p<0.05)。7、14 d时,相比于对照组,PGRN浓度为5,25 ng/ml时,ALP活性明显增强(p<0.05),最高组均出现在25 ng/ml;但浓度为100 ng/ml组的增殖和ALP活性明显低于对照组(p<0.05)。3和7 d时,PGRN浓度在5,25,50 ng/ml时,ALP、Runx2 mRNA表达水平显著高于对照组(p<0.05),且浓度为25 ng/ml时,两者mRNA表达水平最高(p<0.05);浓度为100ng/ml组的ALP、Runx2mRNA表达水平明显低于对照组(p<0.05)。4.2 PGRN增强了正常和炎性环境下PDLSCs的成骨分化7、14 d时,相比于对照组,10 ng/ml TNF-α组明显抑制了 PDLSCs中的ALP活性(p<0.05),而25 ng/ml PGRN组的ALP活性明显增强,10 ng/ml TNF-α + 25 ng/ml PGRN组与对照组相比,无统计学意义(p>0.05)。7、14、21 d 时,与对照组相比,10 ng/ml TNF-α 组的 ALP、Runx2、OPN的mRNA和蛋白表达水平明显下调,25 ng/ml PGRN组的ALP、Runx2、OPN的mRNA和蛋白表达水平明显上调(p<0.05);7、14 d时,10ng/mlTNF-α + 25ng/mlPGRN 组的 Runx2mRNA 表达水平高于对照组,且差异显著(p<0.05);7d 时,10ng/mlTNF-α + 25ng/mlPGRN 组的Runx2蛋白表达水平显著高于对照组(p<0.05);在三个时间点中,25ng/ml PGRN组的各mRNA和蛋白表达水平最高,10 ng/ml TNF-α + 25 ng/ml PGRN组次之。PDLSCs经成骨诱导21d后,10ng/mlTNF-α组抑制了 PDLSCs的矿化,而 25ng/mlPGRN 组促进了 PDLSCs 的矿化(p<0.05),10ng/mlTNF-α+ 25 ng/ml PGRN组与对照组相比无统计学意义(p>0.05)。结论1.PDLSCs的成骨分化和矿化受到成骨细胞的正向影响:成骨细胞增强了PDLSCs的成骨/成牙骨质分化和矿化的能力,成骨细胞与PDLSCs的最佳比例在2:1到1:1范围内时,PDLSCs的成骨分化能力最强;成骨细胞增强PDLSCs的成骨/成牙骨质分化和矿化的机制与其旁分泌的BMP-2有关。2.PDLSCs的成骨分化和矿化受到诸如TNF-α炎性因子的负性影响:TNF-α浓度为10 ng/ml时,对PDLSCs的成骨分化起抑制作用;3.PGRN能直接促进PDLSCs的增殖和成骨分化及矿化,且能逆转TNF-α对PDLSCs成骨分化的抑制作用:PGRN浓度在5,25,50 ng/ml时,能促进PDLSCs的增殖和分化,且最佳浓度为25 ng/ml。