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光动力学疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种结合光敏剂(PS)、特定波长的光照和组织内分子氧，通过光动力学反应生成活性氧自由基(ROS)以实现对靶组织的选择性损伤的治疗方法。光敏剂可选择性浓集于线粒体、内质网(ER)等细胞器中。光敏剂的亚细胞定位是决定PDT抗肿瘤作用机制的关键因素。剧烈的ER应激可介导一条不同于线粒体途径的凋亡通路，使ER成为有重要意义的药物作用靶点。ER定位的PS经PDT处理后产生成的ROS会扰乱ER的内稳态、诱导ER应激的发生，但并不是所有ER靶向定位的PS均能诱导ER凋亡通路的激活。目前缺少能敏感、有效地筛选出ER靶向损伤的光敏抗肿瘤先导化合物的高通量模型。基于以上难点及需求，本研究以荧光素酶报告基因检测法为基础建立ER靶向光敏剂体外筛选模型。模型以ER应激标志基因启动子活性为评价指标，从分子水平对光敏化合物的光动力活性、ER损伤程度做出定量的评价，以期有针对性地寻找具有良好开发潜能的ER靶向光敏剂。 蛋白伴侣GRP78及转录因子CHOP是ER-PDT处理下表达量显著上调的蛋白，这提示GRP78及CHOP可作为报告基因用来评价细胞内部ER所受光动力反应的影响。其中GRP78是ER应激的起始指标，而CHOP是ER应激相关凋亡通路的起始蛋白。应用PCR技术及分子克隆技术，我们分别构建CHOP、GRP78启动子片段与pGL3 luciferase荧光素酶报告质粒的融合重组载体，借助瞬时转染及双荧光素酶报告基因检测实验，联合利用生物信息学分析、基因缺失、定点突变手段，分别查找CHOP、GRP78基因启动子对ER靶向PDT(ER-PDT)的应答区域及核心应答元件。5端连续缺失分析显示GRP78启动子对ER-PDT的应答功能区域位于-702～+52，定点突变证实其中位于-639～-629的HSE元件（热休克元件）是ER-PDT核心响应元件;CHOP启动子对ER-PDT的应答功能区域位于-443～+29，其中位于-103～-75的ERSE元件（内质网应激元件）是核心响应元件。将GRP78、CHOP启动子中响应ER-PDT的核心序列分别克隆进pGL3 luciferase载体中，经瞬时转染形成报告细胞，在PDT处理后检测报告细胞内部相对荧光素酶活性，从而评价化合物的ER靶向性。实验证实PDT作用下GRP78核心启动子驱动的荧光素酶活性可指征化合物的ER靶向性及光动力活性（即ROS生成量）;而PDT作用下CHOP核心启动子驱动的荧光素酶活性可指征光敏化合物对ER的损伤程度（即ER应激激活凋亡的水平）。运用GRP78-CHOP双指标可筛选得到靶向光氧化损伤ER、且能激活ER相关凋亡的光敏药物。内质网靶向的光敏剂Foscan、以及非内质网靶向的光敏剂methylene blue被用于验证GRP78-CHOP双指标筛选模型的敏感性和准确性。综上，我们构建了以GRP78-CHOP启动子响应活性为双指标的ER靶向光敏剂筛选模型，将复杂的光动力氧化损伤ER的检测过程简化为相对成熟的荧光素酶报告基因检测法。 本课题继而着眼于ER凋亡的优势，探究ER-PDT对耐药肿瘤的疗效。第三代铂类药物奥沙利铂(L-OHP)是肠癌治疗的基础化疗药物。L-OHP耐受性阻碍其抗肿瘤疗效。本研究中，我们重点探讨了ER靶向的光敏剂金丝桃素(HY)介导的光动力治疗(HY-PDT)处理耐药性细胞后对L-OHP的增敏作用及相关机制。实验证实HY-PDT预先处理的耐药细胞再孵育L-OHP，通过减少L-OHP的细胞外排，增加L-OHP在胞内的累积量，从而增加L-OHP的增殖抑制能力和凋亡诱导水平。而L-OHP外排的减少依赖于HY-PDT对GS-X泵类药物外排蛋白MRP-2表达的下调、及对MRP-2药物外排活性的抑制。HY-PDT对p-gp的药物外排活性及表达量均没有调控作用。在对谷胱甘肽介导的细胞质解毒系统的功能检测中，HY-PDT诱导生成的ROS可消耗还原型谷胱甘肽(GSH)的含量、抑制谷胱甘肽-S-转移酶的蛋白表达量及酶活性，从而减少GSH对L-OHP的解毒作用。此外HY-PDT与L-OHP联合作用后，DNA双链断裂程度增加。L-OHP通过与DNA交联形成具有细胞毒性的DNA-Pt复合物，实验揭示HY-PDT预处理细胞可降低DNA-Pt的移除速率。此外HY-PDT下调了核苷酸切除修复(NER)过程中的关键酶ERCC1和XPF的表达。而外源性抗氧化剂谷胱甘肽单乙酯(GSH-EE)对肿瘤细胞预孵育能够有效地抑制HY-PDT对L-OHP的增敏作用，表明ROS参与了对L-OHP的增敏过程。综上，HY-PDT通过诱导产生ROS来调控人结肠癌耐药细胞对L-OHP的敏感性，其机制包括影响药物流出，影响GSH参与的解毒作用，影响NER介导的DNA修复。 实验过程中我们发现不能诱导细胞凋亡的低剂量金丝桃素介导的PDT对L-OHP有拮抗作用。对此现象的研究揭示自噬是HY-PDT和L-OHP联合治疗下的另一个重要的生物事件，ER应激对自噬的激活参与了对L-OHP的增敏效果。只有能诱导致死性自噬剂量的ER-PDT才可增敏L-OHP;低剂量ER-PDT激活了细胞保护性的促生存自噬。实验证明不同剂量HY-PDT激活的自噬程度和持续时间的差异，可能是导致自噬对细胞生存/死亡调控作用不同、及对L-OHP化疗敏感性调控作用不同的原因。高剂量HY-PDT导致的大量ROS生成和剧烈ER应激下，CHOP蛋白的诱导表达可能是ER-PDT调控促生存自噬向促死亡自噬转变的一个关键分子开关。CHOP/TRIB3/Akt/mTOR信号轴参与致死性自噬的激活。低剂量HY-PDT因不能诱导CHOP的表达而仅激活了促生存自噬，进而诱导了化疗耐受性。综上，本研究揭示ER-PDT通过ROS诱导的氧化毒性、ER应激激活的致死性自噬，达到增敏耐药细胞的目的。本文阐明了ER-PDT增敏其他化疗药物的可行性及分子机制，拓宽了ER-PDT的临床适用范围。