【摘 要】
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紫杉醇是治疗乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等多种癌症的广谱特效抗癌药物,但现有的紫杉醇生产方法都不能很好的解决紫杉醇产量低的问题无法工业化生产。利用现代分子生物学手段对
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紫杉醇是治疗乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等多种癌症的广谱特效抗癌药物,但现有的紫杉醇生产方法都不能很好的解决紫杉醇产量低的问题无法工业化生产。利用现代分子生物学手段对产紫杉醇内生真菌进行遗传改造,构建高产紫杉醇基因工程菌株成为了研究热点。尽管已从红豆杉细胞中成功克隆出紫杉醇生物合成关键酶基因,但从产紫杉醇的内生真菌中克隆相关酶基因还尚未见有报道;同时,树状多节孢紫杉醇产生菌的遗传背景不清楚,更加提高了高产紫杉醇基因工程菌株的构建难度。本试验在课题组已构建的树状多节孢紫杉醇产生菌HDFS426 cDNA文库基础上,利用文库中与目前报道的紫杉醇生物合成相关酶基因序列相似的EST序列设计引物,通过PCR技术克隆目的基因。试验结果表明,获得了 1条相关酶基因,与GenBank中已收录的基因相似度均达99%,该基因为紫杉烷-13α-羟化酶基因。此外,为了验证获得的基因功能,本试验构建了原核表达载体,将获得的基因与载体pET32a连接,导入表达载体后进行Western blotting验证。试验结果表明,紫杉烷-13α-羟化酶基因具有完整的开放阅读框,能够表达出蛋白,原核表达载体的成功构建为后续进行基因工程菌株的构建奠定了良好的基础。另外,本试验还将实验室自行构建的双元表达载体pBI121-43与所本试验获得的基因和实验室前期获得的基因双酶切后分别连接,将所获得的重组质粒利用根癌农杆菌介导遗传转化法分别转入菌株HDFS426。试验结果表明,重组质粒成功导入了菌株HDFS426,获得4株产紫杉醇基因工程菌株,分别为含紫杉烷-13αα-羟化酶基因的工程菌株（HD-1）,含GGPP合成酶基因的工程菌株（HD-2）,含紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶基因的工程菌株（HD-3）和含紫杉二烯-5α-羟化酶基因的工程菌株（HD-4）,薄层层析法（TLC）结果表明,4株菌株都在与紫杉醇标准品相同位置处出现了特征性蓝色斑点,蓝色斑点的大小和颜色均比标准品的大和深,因此,本试验结果初步推测GGPP合成酶、紫杉烷-13α-羟化酶、紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶和紫杉二烯-5α-羟化酶为树状多节孢内生真菌紫杉醇生物合成途径的相关酶。本试验研究为构建内生真菌紫杉醇高产基因工程菌株提供了相关酶基因,同时也为构建高产紫杉醇基因菌株奠定了坚实的基础,为向早日实现内生真菌紫杉醇工业化迈进了一大步。
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