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肿瘤化疗患者、自身免疫性疾病和器官移植后使用免疫抑制剂的患者，因其免疫功能低下而极易发生感染，但迄今尚未见到任何能够对其进行有效预防的方法和措施。本课题组在前期工作基础上，制备了AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒，建立了免疫抑制小鼠模型，并通过观察rAAV2介导signal108-BPI600-Fcγ1700嵌合基因转染，对免疫抑制小鼠抗感染保护作用的影响，探讨抗感染基因转染在临床感染高危人群中应用的可行性。本课题研究工作分为以下两部分：
第一部分：AAV2-signal108-BP1600-Fcy1700重组病毒的制备。
1.pBV220-signal108-BPI600-Fc1l700中间载体的构建和鉴定。
以HL-60细胞mRNA为模板，通过RT-nested PCR扩增获得signal108-BPI185基因片段。酶切signal108-BPI185基因片段和pBV220-BPI420-Fcγ1700重组质粒，通过连接反应获得pBV220-signal108-BPI600-Fcγ1700中间载体。将上述重组质粒转化E.coli DH5α获得阳性克隆菌，提取质粒进行酶切分析和DNA测序，结果与实验预期相符。
2.pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒的构建和鉴定。
酶切重组质粒pBV220-signal108-BPI600-Fcγ1700和pSNAV载体质粒，通过连接反应获得pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒。将上述重组质粒转化E.coliDH5α获得阳性克隆菌，提取质粒进行酶切分析和DNA测序，结果与实验预期相符。
3.AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒的制备及其纯度和滴度的测定。
采用脂质体转染法，将pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒导入BHK-21细胞，经抗生素G418加压筛选获得携带signal108-BPI600-Fcγ1700目的嵌合基因的载体细胞株。用重组HSV1-rc/△UL2辅助病毒感染上述载体细胞株，获得AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒(简称rAAV2-BF)。采用SDS-PAGE测定rAAV2-BF纯度大于95％；以地高辛标记的CMV启动子序列为探针，采用点杂交法测定rAAV2-BF的滴度为2×1012v.g./ml。
第二部分：rAAV2-BF转染对免疫抑制小鼠抗感染保护作用的研究。
1.目的重组蛋白在CHO-K1细胞中的表达。
rAAV2-BF转染CHO-K1细胞后收获培养上清，dot-blot证实目的重组蛋白在CHO-K1细胞中得到表达；Western-blot检测显示目的重组蛋白还原后，在泳道上出现一条相对分子量为48KD的条带；在未还原情况下，泳道上出现一条相对分子量为96KD的条带，与实验设计预期结果相符。
2.目的基因产物在小鼠骨骼肌细胞中的表达。
提取rAAV2-BF转染组小鼠注射部位肌肉组织mRNA，其RT-PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上出现一条约300bp的DNA条带，与预期产物大小相符，表明目的基因在转录水平得到表达。石蜡切片免疫组化检测结果显示：rAAV2-BF转染组小鼠注射部位肌纤维呈棕黄色，表明目的基因在蛋白水平得到表达。
3.小鼠血清中目的基因产物及其主要生物学作用的检测。
改良酶联免疫吸附实验和dot-blot实验证实：rAAV2-BF转染组小鼠血清中存在目的基因产物即BPI23-Fcγ1重组蛋白；该重组蛋白具有中和内毒素、杀伤肺炎克雷伯杆菌和介导调理吞噬的作用。
4.免疫抑制小鼠模型的建立。
用氢化可的松和环磷酰胺腹腔注射建立免疫抑制小鼠模型，通过检测小鼠脾重、脾/体比值、脾脏T、B细胞增殖能力和腹腔巨噬细胞吞噬功能，证实免疫抑制小鼠模型建立成功。
5.rAAV2-BF转染小鼠对MLD肺炎克雷伯杆菌感染攻击的抵抗作用
正常和免疫抑制小鼠对肺炎克雷伯杆菌感染的最小致死量(MLD)分别为5×105CFU/只和1×105CFU/只。MLD肺炎克雷伯杆菌腹腔感染后，rAAV2-BF转染组正常和免疫抑制小鼠的存活率分别为40％和46％，显著高于各自相应的PBS对照组小鼠(存活率6.5％，4.5％)。上述试验结果证实rAAV2-BF转染可显著增强正常和免疫抑制小鼠对MLD肺炎克雷伯杆菌感染攻击的抵抗作用；表明rAAV2-BF转染可使免疫抑制小鼠获得与正常小鼠类似的抗感染保护效应。
6.rAAV2-BF转染组免疫抑制小鼠抗感染作用机制的研究。
MLD肺炎克雷伯杆菌感染攻击后，rAAV2-BF组免疫抑制小鼠血清中细菌数、内毒素、促炎细胞因子(IL-1β，TNF-α)含量和主要脏器中的细菌数均显著低于PBS组免疫抑制小鼠。rAAV2-BF组免疫抑制存活小鼠各主要脏器病理学变化较轻，濒死PBS组免疫抑制小鼠各主要脏器血管扩张、淤血明显，与内毒素休克死亡引发的病理学改变相符。上述结果为rAAV2-BF组免疫抑制小鼠细菌感染后的高存活率提供了实验依据。证实肺炎克雷伯杆菌感染后引发的内毒素中毒性休克是小鼠死亡的主要原因。
本试验建立免疫抑制小鼠模型模拟临床使用免疫抑制药物的感染高危人群，首次证实rAAV2-BF转染可显著增强免疫抑制小鼠对致死性肺炎克雷伯杆菌感染攻击的抵抗作用。提示抗感染基因转染用于临床高危感染人群，有可能获得较好的抗感染保护作用。