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萜类是自然界存在的一类由异戊二烯为结构单元的化合物的总称,是迄今所发现的植物次生代谢物中最大的一个家族,具有多种化学生态学效应,如植物花香挥发物的主要成分之一就是萜烯类化合物,可作为重要的表达信号来引诱昆虫进行授粉和受精;同时当植物受到昆虫侵袭时,会释放大量的挥发性萜类,用于吸引昆虫的天敌而使自身免受伤害。此外,萜类化合物在植物与植食性昆虫以及病原菌互作中发挥重要作用,直接或间接参与植物的防御反应。毛竹(Phyllostachys edulis)是禾本科植物中最具有代表性的林业资源,也是竹亚科中最具生态和经济价值的物种,同时由于其分布广泛、经济价值高、加工产品丰富等特点,因而被广大研究人员作为竹亚科模式植物进行研究。毛竹基因组数据库已于2013年完成测序,但其中大多数基因的功能尚不清楚,而本文则利用分子生物学手段旨在从毛竹基因组中分离出萜类合成酶的相关基因(MoTPS),获取完整的各基因编码序列,再分别采用原核表达和真核表达系统获得MoTPS高效表达的工程菌,然后对各融合蛋白进行分离和纯化,并进一步鉴定其功能。该项研究对阐明毛竹萜类代谢途径及其关键酶的功能具有重要意义,同时也为萜类的工业化发酵生产提供借鉴和改造靶点。本文的主要研究结果如下:1.基于毛竹基因组数据信息,通过KEGG注释从中筛选出潜在的萜类合成酶基因共15条,命名为MoTPS1-15。通过构建进化树分析发现其中有8条基因(MoTPS1-8)归属于Tpsa亚族,负责编码倍半萜和二萜合成酶基因,有4条基因(MoTPS10-12/14)归属于Tpsb亚族,负责编码单萜合成酶,MoTPS13属于Tpsg亚族,而MoTPS9和MoTPS15则不属于任何已知的萜类合成酶家族。对这15条基因编码的蛋白进行定位分析,发现其大多数存在于胞质中,少部分位于叶绿体中,与植物体内的两条萜类生物合成途径相呼应。实验过程中通过梯度PCR改变退火温度,并使用不同的毛竹组织样品为扩增模板,成功获得8条基因的完整序列,分别为MoTPS2/3/5/6/11-14,其中MoTPS12和MoTPS13这2条基因由于可变剪接方式的不同而产生两个转录本,分别标记为MoTPS12S和MoTPS13S。2.原核表达体系采用了5种表达载体,分别为pgex4t-1、pet30a(+)、pet32a(+)、pet28a-sumo和pcoldi-sumo载体,将上述10条基因经合适的限制酶处理后分别与载体连接,成功构建出pgex4t-1-motps2/12/12s/13/13s、pet30a-motps2、pet32a-motps2/12/12s/13/13s、pet28a-sumo-motps2/5/6和pcoldi-sumo-motps2/5/6/14共18种原核表达重组质粒,随后将其分别转化到不同的大肠杆菌株系中进行表达,获得了28种相应的阳性克隆菌株,通过对这28种工程菌进行合适的诱导表达和条件优化,结果发现其中绝大多数实现了目的蛋白的表达,但全部是以包涵体的形式存在,可于超声破碎后的沉淀组分中检测出。3.真核表达过程中涉及到两种表达载体ppic9k和ppiczαa,其构建的重组质粒经转化毕赤酵母后可实现分泌型表达,保留了原蛋白活性,方便进行下步的酶活分析。该过程成功构建了ppic9k-motps2和ppiczαa-motps2/3/5/6/12/12s/13/13s/14共9种酵母表达重组质粒,并通过电转化分别将其整合到毕赤酵母染色体上,通过pcr筛选获得相应的阳性克隆。通过对这9种重组酵母菌进行甲醇诱导和表达条件优化,成功得到了4种可溶性萜类合成酶的表达上清液,分别为motps2/5/6/14。对motps2基因来说,ppic9k-motps2转化毕赤酵母gs115菌株诱导目的蛋白的表达效果较ppiczαa-motps2的好,诱导过程中额外添加了1%酪蛋白氨基酸于mm培养基(ph4.0)中进行发酵,48小时后即可检测到目的蛋白。另三种重组质粒ppiczαa-motps5/6/14均转化毕赤酵母x-33菌株,诱导效果良好,于bmmy培养基(ph6.0)中进行发酵,其中ppiczαa-motps5在诱导24小时后即可检测出目的蛋白,而ppiczαa-motps6/14则需在诱导48小时后才能检测到。4.收集到的四种酶液经初步纯化后可用于体外酶活分析,实验过程中需添加fpp、gpp和ggpp作为底物,采用spme顶空萃取技术捕获挥发性萜类,并通过gc-ms分析鉴定酶促反应产物,同时与标准品进行比对,成功鉴定出了3种基因的功能,即motps2、motps5和motps6。其中motps2能催化fpp合成(e,e)-金合欢醇,motps6能催化fpp合成(e)-橙花叔醇,推测其分别为编码金合欢醇合成酶和橙花叔醇合成酶的基因,而motps5的酶促产物鉴定为(e,e)-金合欢醇和(e)-橙花叔醇的混合物,其中以金合欢醇为主,由此推测其为多产物的萜类合成酶编码基因。motps2、motps5和motps6均属于tpsa亚族,分别编码546、541和541个氨基酸,我们将三条基因序列提交到NCBI数据库,并获取了登录号:MoTPS2(KP097716.1),蛋白序列为AJP67536.1;MoTPS5(KP097717.1),蛋白序列为AJP67537.1;MoTPS6(KP097715.1),蛋白序列为AJP67535.1。在毛竹的生长过程中,萜类化合物充当重要的生理生态作用。本文是对毛竹体内萜类合成途径探索的首次报道,系统阐述了毛竹体内潜在的萜类合成酶基因以及其功能,这将有助于理解萜类的生物合成以及为工业化生产萜类奠定基础。