论文部分内容阅读
第一部分DJ-1在肝细胞癌中的表达及其预后价值目的：DJ-1作为新近发现的癌基因参与多种恶性肿瘤的发病机制。本研究旨在探讨DJ-1在人肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)临床病理组织标本中的表达,及其与HCC临床病理变量和生存预后的关联性。方法：收集149例未经治疗的HCC组织标本,所有标本均具备完整的临床病理及随访预后资料。采用逆转录聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)、免疫组织化学染色和Western Blot方法,检测DJ-1在HCC中的表达,统计分析DJ-1的表达与临床病理变量及生存预后的关联性。结果：与对应的癌旁组织、肝硬化组织和正常肝脏组织比较,DJ-1在HCC组织中显著高表达；Pearson卡方检验分析表明,DJ-1表达与术前AFP水平、肝硬化程度、门静脉侵犯与否、分化程度和Edmondson分期等临床病理变量密切相关；DJ-1高表达组患者的无瘤生存时间和总体生存时间明显短于DJ-1低表达组；多因素Cox比例风险模型分析显示,DJ-1为判断HCC患者总体生存时间的独立预后因素(HR,2.568；P=0.003)；相关性分析表明,HCC组织中DJ-1与抑癌基因PTEN表达显著性负相关(r=-0.836,P<0.001)。结论：DJ-1在HCC组织标本中高表达。DJ-1的表达水平与HCC临床病理资料及患者预后相关,说明DJ-1在HCC的发生、发展中起到重要作用。第二部分DJ-1在人肝癌细胞株的表达及其shRNA稳定转染HepG2细胞系的建立目的：检测DJ-1在人肝癌细胞株的表达,构建针对DJ-1的小发夹RNA (small hairpin RNA, shRNA)真核表达载体,获取干扰DJ-1表达的质粒,转染人肝癌HepG2细胞,稳筛后挑选亚克隆细胞系。方法：在不同的人肝癌细胞株中,应用Western Blot及免疫细胞化学法检测DJ-1的表达水平及细胞定位；设计干扰DJ-1表达的shRNA序列结构,构建RNA干扰(RNA interference, RNAi)真核表达载体pGenesil-1.1质粒,经过酶切、测序鉴定；干扰质粒经脂质体介导转染人肝癌细胞HepG2,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系；利用半定量RT-PCR及Western Blot分别检测筛选亚克隆细胞系的mRNA和蛋白表达。结果：DJ-1在人肝癌细胞株：HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H、SMMC-7721及Huh-7中高表达,且不同肝癌细胞株中DJ-1表达存在差异(P<0.05),但在对照组人胚胎肝细胞L02中表达缺失。激光共聚焦显示,DJ-1表达主要定位于肝癌细胞胞质；合成并构建DJ-1 shRNA质粒载体,双酶切后电泳测序证实DJ-1干扰序列及读码框完全正确；成功筛选稳定转染干扰质粒的HepG2亚克隆细胞系,荧光显微镜下呈现绿色荧光,半定量RT-PCR检测显示干扰质粒明显抑制DJ-1 mRNA表达,Western Blot检测DJ-1蛋白抑制率为98.78%(P<0.05)。结论：DJ-1在人肝癌细胞株胞质高表达,且其表达程度与肝癌细胞恶性生物学特性相关；成功构建DJ-1 shRNA真核表达载体,建立干扰质粒稳定转染HepG2细胞系亚细胞克隆,为以DJ-1基因为靶点的人肝癌基因治疗的理论研究提供实验基础。第三部分shRNA抑制DJ-1表达在人肝癌细胞HepG2中调控Akt/NF-kappaB信号通路目的：研究癌基因DJ-1在人肝癌细胞株HepG2中对Akt/NF-KB信号通路的调控作用。方法：应用Western Blot方法在不同的人HCC细胞株,HepG2、SMMC-7721、Huh-7、Hep3B、MHCC-97L和MHCC-97H中检测癌基因DJ-1和抑癌基因PTEN的表达。采用基因沉默shRNA技术,在人HCC细胞HepG2中特异性稳定抑制DJ-1表达。离体及在体观察,DJ-1潜在作用靶点：Akt和磷酸化Akt、核因子κB (nuclear factor kappaB, NF-κB)及其抑制因子(inhibitor of NF-κB, IκB)的表达差异性。流式细胞检测法研究细胞周期转换、MTT比色法判断细胞增殖能力、黏附侵袭实验观察细胞黏附转移能力；建立HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤模型,评估DJ-1对成瘤能力的影响。结果：DJ-1在不同转移潜能的人肝癌细胞株：HepG2、SMMC-7721、Huh-7、Hep3B、MHCC-97L和MHCC-97H中高表达,且不同肝癌细胞株中DJ-1表达存在差异(P<0.05); PTEN在人肝癌细胞株中低表达；成功构建DJ-1 shRNA真核表达载体,建立干扰质粒稳定转染HepG2细胞系亚细胞克隆；与对照组及HepG2组相比,干扰DJ-1表达组在裸鼠皮下种植瘤模型中肿瘤生长缓慢(P<0.05)；在HepG2细胞及裸鼠动物模型组织标本中,干扰DJ-1表达上调PTEN表达水平、抑制Akt磷酸化及NF-κB的激活；在HepG2细胞中干扰DJ-1表达,抑制细胞分化增殖、降低细胞黏附侵袭、阻滞细胞G1/S周期转换。结论：shRNA介导的RNAi干扰DJ-1的表达,抑制Akt磷酸化及NF-κB激活入核,上调PTEN表达水平；干扰DJ-1表达能够抑制HepG2细胞增殖、黏附及侵袭能力。DJ-1参与对Akt/NF-KB信号通路的调控,在HCC的肿瘤发生机制中发挥着重要作用。