【摘 要】
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目的建立携带生长相关蛋白-43(growth associated protein,GAP-43)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,
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目的建立携带生长相关蛋白-43(growth associated protein,GAP-43)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,为进一步以基因治疗途径研究GAP-43对大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)损伤修复的影响奠定基础,并探讨RFP作为报告基因的优势。方法以pDsRed1-C1质粒为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction PCR)扩增RFP编码序列:DNA片断;将重组质粒pAAV-GAP43-EGFP和RFP基因分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切,纯化回收后的pAAV-GAP43和RFP经T4DNA连接酶连接构建pAAV-GAP43-RFP。采用菌落PCR筛选阳性克隆,限制性内切酶分析和DNA测序确证插入DNA序列的正确性及开放读码框的正确性;采用脂质体法将pAAV-GAP43-RFP及另外两种辅助质粒pHelper和pAAV-RC共转染AAV-293细胞,荧光显微镜下观察GAP43-RFP融合蛋白的表达。结果1.PCR扩增RFP开放读码框:以pDsRed1-C1为模板,红色荧光蛋白引物进行PCR, PCR扩增产物经1.2 %的琼脂糖凝胶中电泳,结果在预期位置有特异性扩增的目的片断(680bp)。
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