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目的：
本研究拟从脑缺血再灌注后PI3-K/Akt信号转导通路方面入手,探讨白花前胡合剂抗脑缺血再灌注损伤的作用机制,为临床实践进一步提供实验依据。
方法：
1)将110只体重280～32Og的健康雄性SD大鼠随机分为正常组,假手术组,脑缺血再灌注组(模型组)、白花前胡合剂+缺血再灌注组(白花前胡合剂组)、白花前胡合剂+缺血再灌注+LY294002组(抑制剂组)五组,每组22只大鼠。假手术组和模型组给予生理盐水2m1灌胃,每日2次,连续7日。白花前胡合剂组、抑制剂组予白花前胡合剂6ml/kg.d,分2次灌胃,灌胃时将白花前胡合剂用生理盐水稀释到2m1,连续7日。第7天灌胃完成30min后开始造模,采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,术后2小时进行再灌注。其中抑制剂组于再灌注前15min经尾静脉注射0.3mg/kg LY294002。假手术组线拴插入深度为8～10mm,其余操作同手术组。
2)脑缺血再灌注24h进行神经功能缺损评分。运用HE染色观察McAO大鼠缺血侧脑组织的病理形态学改变。行TTC染色观察梗死面积比。
3)脑缺血再灌注24h,运用免疫组织化学法及western blot法观察白花前胡合剂对缺血脑组织PI3-K、Akt蛋白表达的影响。
4)脑缺血再灌注24h,TUNEL法检测脑组织神经细胞凋亡,并用免疫组织化学方法检测缺血区脑组织caspase-9表达水平。
5)脑缺血再灌注24h,采用ELISA法检测血清TNF-α含量,Westernblot法检测脑组织NF-κB、COX-2的表达量。
6)脑缺血再灌注24h,用免疫组织化学方法检测缺血区脑组织HIF-1a、VEGF水平。
结果：
1)各组大鼠脑缺血再灌注24h神经功能缺损情况观察:假手术组大鼠活动正常,步态平稳,肌力无减弱,未出现明显的神经功能缺损症状;与假手术组比较,模型组大鼠出现明显的运动功能障碍,神经功能评分明显升高(P＜0.05);白花前胡合剂组可明显改善缺血再灌注损伤大鼠的运动障碍,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05),抑制剂组大鼠神经功能评分较之模型组有一定的降低,但无统计学差别,与白花前胡组比较则有显著性差异(P＜0.05)。
2)各组大鼠脑缺血再灌注24h病理组织学变化:正常组与假手术组HE染色显示大脑皮层及海马区神经元排列整齐有序,结构清晰。模型组大鼠缺血核心区细胞数明显减少,核固缩深染,组织疏松,有细胞肿胀、胞核溶解、碎裂等细胞坏死特征。缺血周围区细胞体积缩小,数量减少,层次不清,排列也较为紊乱,胞核固缩浓染,间质水肿。白花前胡合剂组缺血核心区及半影区较模型组神经细胞层次较清楚,数目增加,且较为完整,间质水肿减轻,抑制剂组病理损伤较模型组类似。
3)各组大鼠脑缺血再灌注24hTTC染色结果:在假手术组TTC染色呈均匀的橘红色,未检测到脑梗死病灶。脑缺血再灌注组大鼠脑组织出现大面积梗死。白花前胡合剂组大鼠脑梗死体积显著减少,与模型组相比有显著性差异(P＜0.05);而抑制剂组可抑制白花前胡合剂减轻大鼠脑梗死体积的作用,抑制剂组梗死体积与模型组差异无显著性(P＞0.05),与白花前胡合剂组比较有显著性差异(P＜0.05)。
4)各组大鼠脑缺血再灌注24h脑组织PI3-K/p-Akt免疫组织化学检测:假手术组脑组织PI3-K和p-Akt阳性细胞比较散在,分布在大脑皮质及皮质下组织;脑缺血再灌注24h后,模型组缺血侧脑组织PI3-K、p-Akt阳性细胞数较正常组无明显变化;脑缺血再灌注前予白花前胡合剂处理显著增加缺血侧脑组织PI3-K和p-Akt的表达,主要分布于缺血脑组织及缺血周边区;而抑制剂组抑制了白花前胡合剂的这一作用。
5)各组大鼠脑缺血再灌注24h脑组织PI3-K/p-Akt western blot检测:对缺血侧半暗带区进行检测发现,脑缺血再灌注24h,模型组PI3-K、p-AKT的蛋白含量未见明显变化,假手术组亦趋于稳定。与模型组比较,白花前胡合剂处理后能显著增加PI3-K、p-AKT的表达(P＜0.05)。抑制剂组则削弱了白花前胡合剂的此种作用。
6)各组大鼠脑缺血再灌注24h后TUNEL染色:假手术组基本未见TuNEL阳性细胞,模型组再灌注24h后可见TUNEL细胞,与假手术组相比较有非常显著性差异(P＜0.01)。与模型组相比,白花前胡合剂处理能明显减少大鼠脑缺血再灌注损伤后TUNEL阳性细胞数目(P＜0.05)。而抑制剂组则削弱了白花前胡合剂这种作用。
7)各组大鼠脑缺血再灌注24h脑组织Caspase-9免疫组织化学检测:与假手术组相比,模型组脑缺血再灌注24h后caspase-9的表达明显增加(p＜0.01)。与模型组相比,白花前胡合剂组能使Caspase-9的染色变浅,并明显减少Caspase-9阳性细胞的数目(p＜0.05),这一效应能被抑制剂所拮抗。
8)各组大鼠脑缺血再灌注24h血清炎症介质TNF-α的ELISA检测:假手术组与正常组相比,TNF-a的分泌没有差异性。脑缺血再灌注24h,大鼠血清炎症介质TNF-a的含量较正常组显著升高(P＜0.01)。与模型组相比,白花前胡合剂可明显降低血清TNF-a的含量(P＜0.01),白花前胡合剂组这种作用被LY294002抑制(P＜0.05)。
9)各组大鼠脑缺血再灌注24h脑组织NF-κB、COX-2 Western blot检测:假手术组与正常组相比,NF-κB、COX-2蛋白表达没有差异性。模型组大鼠NF-κB和COX-2在缺血脑组织的表达显著升高(P＜0.01),白花前胡合剂组可明显降低缺血脑组织NF-κB和COX-2的表达(P＜0.05),这种作用被抑制剂所抑制(P＜0.05)。
10)各组大鼠脑缺血再灌注24h脑组织HIF-1a/VEGF免疫组织化学检测:脑缺血再灌注24h后,模型组缺血侧脑组织HIF-1a/VEGF阳性细胞数较正常组显著增加,与假手术组相比有非常显著性意义(p＜0.01);白花前胡合剂组显著增加缺血侧脑组织HIF-1a/VEGF的表达,与模型组相比有显著差异(p＜0.05或p＜0.01)。而抑制剂组则消减了白花前胡合剂的这一作用。
结论：
1)通过大鼠神经功能缺损症状评分证实了白花前胡合剂具有减轻脑缺血再灌注后的神经功能缺损的功效。TTC染色显示白花前胡合剂能减少梗死面积。光镜的结果显示白花前胡合剂能够改善脑缺血再灌注后神经细胞的病理形态,增加正常神经细胞的数目,减轻细胞水肿、减少神经元变性坏死。
2)进一步揭示了在脑缺血再灌注损伤的机制中,PI3-K/Akt信号转导通路的激活可能起到非常重要的作用。证实了凋亡相关基因Caspase-9和核转录因子NF-κB、炎症细胞因子TNF-a、COX-2均参与了脑缺血损伤的病理过程。在脑缺血再灌注损伤的保护机制中,HIF-1a、VEGF起到促进血管新生、神经细胞修复作用。
3)从分子层面上揭示了中药复方白花前胡合剂对脑缺血再灌注损伤具有脑保护作用。白花前胡合剂可激活脑缺血再灌注后PI3-K/Akt信号转导通路,并通过PI3-K/Akt信号途径降低缺血脑组织Caspase-9表达,减少神经细胞凋亡。减少TNF-a合成和分泌,抑制NF-κ B、COX-2的蛋白合成,减轻再灌注后炎症反应,从而阻断脑缺血后病理级联反应的部分环节。增加HIF-1a、VEGF表达,促进血管新生,促进卒中的康复。