论文部分内容阅读
第一部分无烟气烟草水提取物对线粒体损伤作用的研究目的：研究无烟气烟草水提取物（Smokeless tobacco water extract，STWE）对线粒体的损伤作用。方法：选取人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5为工具细胞，常规培养，当细胞贴壁率达到90%以上后，收集细胞进行以下实验。（1）采用MTT法观察不同浓度STWE对HepG2和MRC-5细胞的增殖影响，计算上述细胞的半数抑制浓度IC50。以STWE最大可配浓度10mg/ml为初始浓度，倍比稀释为STWE不同作用浓度，同时设置空白对照，37℃，5%CO2培养箱中孵育48h后，检测490nm处吸光度值（OD值），计算IC50。（2）根据MTT实验结果，在HepG2和MRC-5细胞上，选取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三个STWE作用浓度，同时设空白对照，作用24h。透射电镜检测细胞形态学改变。（3）选取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三个STWE浓度，检测STWE线粒体毒性。①线粒体膜电位检测：JC–1试剂盒检测各实验组细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平。②细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测：GEMNED活性氧高质荧光检测试剂盒，检测各实验组细胞ROS水平。③线粒体DNA编码基因检测：提取各实验组细胞total RNA，逆转录合成cDNA，Real-Time PCR法检测线粒体DNA编码12S rRNA、NDⅠ、COXⅡ基因表达水平。（4）细胞凋亡检测：FITCAnnexin VApoptosis Detection Kit Ⅰ检测各实验组细胞凋亡水平。（5）细胞周期检测：Real-Time PCR法检测细胞周期相关基因P53、CDK2和MDM2基因表达水平。结果：（1）MTT结果显示，梯度浓度STWE作用48h后， HepG2、MRC-5细胞增殖率成剂量依赖性下降。HepG2、MRC-5两种细胞的IC50值分别为447.00μg/ml和441.00μg/ml。据此选取IC50上下三个剂量625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml为给药剂量。（2）细胞形态学透射电镜检测结果：与空白对照组相比，STWE各剂量组细胞出现不同程度的细胞微绒毛减少或消失、空泡、水肿、细胞核及染色质皱缩等改变，以625.00μg/mlSTWE组细胞损伤最明显。（3）①线粒体膜电位流式细胞仪检测结果显示，STWE能剂量依赖性地降低HepG2和MRC-5细胞线粒体膜电位。②细胞ROS流式结果显示，STWE能剂量依赖性地增加HepG2和MRC-5细胞ROS水平。③线粒体DNA编码基因检测结果：与空白对照组相比，STWE各剂量组均可上调HepG2细胞和MRC-5细胞线粒体DNA编码的12SrRNA、NDⅠ、COXⅡ基因mRNA表达水平。（4）细胞凋亡流式结果显示：与空白对照组相比，STWE能剂量依赖性地升高细胞凋亡水平。（5）细胞周期检测：与空白对照组相比，STWE各剂量组细胞的周期相关基因CDK2、MDM2mRNA水平表达在HepG2和MRC-5细胞内都升高，而HepG2中未检测到P53基因表达，MRC-5细胞P53表达降低。结论：STWE对人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5线粒体都有不同程度的损伤作用，且剂量依赖性造成线粒体膜电位下降、细胞凋亡率增高、活性氧产生增多，并且有引起细胞恶变的趋势。第二部分NLRP3炎症小体在无烟气烟草水提取物致线粒体损伤中的作用目的：研究不同浓度STWE作用下，人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5及小鼠肺组织内NLRP3炎症小体表达变化，探讨NLRP3炎症小体及其效应因子在线粒体损伤中的作用。方法：（一）体外实验。根据第一部分实验结果，选取312.50μg/ml和156.25μg/ml的STWE为给药浓度。实验共五组，分别为：空白对照组、156.25μg/ml STWE组、单独LPS刺激4h组、LPS预处理4h+156.25μg/mlSTWE组、LPS预处理4h+312.50μg/ml STWE组。（1）提取各实验组细胞total RNA，Real-Time PCR检测NLRP3炎症小体各组分基因NLRP3、ASC和Caspase-1的表达变化。（2）提取各组细胞总蛋白，Western Blot检测炎症小体相关组分蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化。（3）收集各组细胞培养液上清，使用Human IL-1βImmunoassay Kit测定NLRP3炎症小体激活后释放的主要效应因子IL-1β的浓度。（二）体内试验。清洁级C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，随机分为生理盐水对照组、5mg/kg STWE组、10mg/kg STWE组、20mg/kg STWE组，连续灌胃给药15天。（1）给药结束后，取小鼠肺脏组织做病理切片，观察不同浓度组STWE对肺组织的损伤。（2）同时，取小鼠肺脏组织做免疫组化，检测不同STWE剂量组小鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。结果：（一）体外实验。（1）RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再联合不同浓度STWE刺激组NLRP3、ASC和Caspase-1基因表达水平均显著性升高（P<0.05）。（2）Western Blot结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再联合两个剂量STWE刺激组NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平均明显升高。（3）酶联免疫吸附实验结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再给予不同浓度STWE刺激组IL-1β蛋白分泌水平均显著性升高（P<0.05）。（二）体内实验。（1）病理组织结果显示，生理盐水对照组和5mg/kgSTWE作用组肺组织基本正常，10mg/kg及20mg/kg STWE组肺组织则分别出现不同程度的巨噬细胞聚集和局灶性炎症。（2）免疫组化结果显示，生理盐水对照组NLRP3、ASC和Caspase-1表达很低，随着STWE作用浓度的升高，三者的表达呈上升的趋势。IL-1β和IL-18在生理盐水对照组和5mg/kg STWE组小鼠肺脏组织细胞中无表达或表达非常低，10mg/kg和20mg/kg STWE组表达有升高趋势。结论：体外实验证实STWE能够激活NLRP3炎症小体，促进NLRP3、Caspase-1、ASC等的表达。体内实验证明高剂量的STWE同时能促进炎症因子IL-18和IL-1β的分泌和表达的趋势。第三部分NLRP3、ASC和Caspase-1三种基因敲除小鼠的饲养、繁殖与基因型鉴定目的：饲养、繁殖及鉴定NLRP3基因敲除小鼠、ASC基因敲除小鼠和Caspase-1基因敲除小鼠，为本课题组后续实验研究提供模型动物。方法：将引进的NLRP3+/-小鼠、ASC+/-小鼠、Caspase-1+/-小鼠进行饲养及品系内配种繁殖，提取子代小鼠的耳朵基因组DNA，用PCR方法和T7E1酶切法鉴定基因型，依照孟德尔遗传定律可能得到野生型、杂合子及纯合子三种基因型。结果：成功掌握了NLRP3、ASC和Caspase-1三种基因敲除小鼠的饲养及繁殖技术，并分别获得了较多的上述三种基因敲除纯合子小鼠。结论：正确的小鼠饲养、繁殖及鉴定方法，有助于快速获得NLRP3、ASC、Caspase-1三种基因敲除纯合子小鼠。