论文部分内容阅读
一、目的和意义赤潮是海洋内浮游生物(主要是藻类)暴发性繁殖引起海洋水体变色、变味的一种有害生态异常现象,是一种严重恶化海洋环境,破坏海洋渔业资源和沿海旅游业,并严重威胁人类健康的海洋自然灾害。近年来,随着水体富营养化程度的加剧,导致藻类大量繁殖。其中某些藻类会产生藻毒素,大部分毒素具有水溶性,直接污染了水体。含有毒素的藻类通过食物链毒化海洋鱼、贝类,人类食用染毒的贝类可发生食物中毒或死亡。引起记忆丧失性贝毒中毒的毒素是软骨藻酸( Domoic acid, DA ),硅藻为软骨藻酸的主要来源。软骨藻酸是一种神经性毒素,目前的研究认为,软骨藻酸的毒性作用机制可能为:⑴作用于谷氨酸受体,与内源性神经递质协同发挥毒性作用;⑵细胞内钙离子超载,细胞钙稳态发生异常改变,信号转导紊乱;⑶能量代谢紊乱,使神经元不具有足够的代谢能量来维持正常的静息膜电化学梯度。现在的研究表明:神经胶质细胞构成大脑微环境,调节神经递质代谢,影响突触传导,影响脑高级整合功能;神经胶质细胞还分泌多种生长因子,在神经生成和早期发育中,促进神经元分化、增殖。神经胶质细胞在神经发育和再生中担负着重要作用,特别是中枢神经系统。研究证实,氧自由基大量生成引起脂质过氧化损伤,生物膜含有丰富的不饱和脂肪酸(PUFA),因此极易受到损害。HO-1是一种氧化应激内源性诱导型保护性蛋白,细胞在缺氧、氧化应激、氧化型低密度脂蛋白(Oxided low density lipoprotein, ox-LDL)、重金属、内毒素等应激条件下其表达增高,它具有抗炎、抗凋亡、抗氧化损害等保护作用。各组织细胞中的HO-1受不同应激而诱导,通过上调HO-1基因表达来防御由细胞因子诱导的氧化应激和凋亡。本研究主要以原代培养的大鼠神经胶质细胞为模型,研究软骨藻酸对神经胶质细胞的细胞毒性作用、氧化损害作用和膜损伤作用。二、研究方法1.大鼠神经胶质细胞的原代培养及其免疫细胞化学法鉴定2.MTT法测定软骨藻酸对神经胶质细胞存活率的影响3.化学比色法测定软骨藻酸对神经胶质细胞MDA含量和SOD活力的影响4.免疫荧光细胞化学法测定软骨藻酸对神经胶质细胞HO-1蛋白表达的影响5.RT-PCR法测定软骨藻酸对神经胶质细胞HO-1 mRNA表达的影响6.化学比色法测定软骨藻酸对神经胶质细胞Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响7.荧光分光光度法测定软骨藻酸对神经胶质细胞膜流动性的影响8.流式细胞仪法测定软骨藻酸对神经胶质细胞膜通透性的影响三、结果1.免疫细胞化学法鉴定神经胶质细胞的结果:GFAP的免疫组化完成后,镜下可见绝大部分细胞的胞浆被染成黄褐色。通过扫描仪以及相应软件分析系统进行阳性细胞扫描,证明GFAP阳性细胞数在90%以上,因此可以将此原代培养细胞作为神经胶质细胞体外模型。2.MTT法测定软骨藻酸对神经胶质细胞存活率的影响结果:软骨藻酸对神经胶质细胞具有细胞毒性作用,随着染毒剂量的升高与染毒时间的延长,神经胶质细胞的存活率逐渐下降,并且具有一定的剂量-时间-效应关系。3.化学比色法测定软骨藻酸对神经胶质细胞MDA含量和SOD活力的影响结果:软骨藻酸可诱导神经胶质细胞MDA含量升高,中、高剂量组的MDA含量与对照组相比,差异具有显著性。软骨藻酸可导致神经胶质细胞SOD活力下降,在中、高剂量组中,SOD的活力与对照组相比差异具有显著性。提示软骨藻酸对神经胶质细胞具有氧化损害作用。4.免疫荧光细胞化学法测定软骨藻酸对神经胶质细胞HO-1蛋白表达的影响结果:以平均荧光强度表示免疫荧光细胞化学法测定神经胶质细胞胞浆内HO-1蛋白的表达量,结果显示:软骨藻酸可诱导神经胶质细胞血红素氧化酶-1(HO-1)表达增高,三个剂量组与对照组相比,平均荧光强度都显著升高。5.RT-PCR法测定软骨藻酸对神经胶质细胞HO-1 mRNA表达的影响结果:以目的条带光密度与相应GADPH条带光密度的比值表示HO-1 mRNA表达的相对量,结果表明:软骨藻酸可诱导HO-1 mRNA表达升高,三个剂量组均比对照组显著增高。6.化学比色法测定软骨藻酸对神经胶质细胞Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响结果:软骨藻酸作用24 h后,神经胶质细胞Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均显著受到抑制。7.荧光分光光度法测定软骨藻酸对神经胶质细胞膜流动性的影响结果:膜的流动性常用细胞膜的粘滞系数η表示。η越小,表示流动性越大;η越大,流动性越小。软骨藻酸作用后,三个剂量组与对照组相比,细胞膜的粘滞系数均显著升高,即细胞膜的流动性下降,细胞膜功能受损。8.流式细胞仪法测定软骨藻酸对神经胶质细胞膜通透性的影响结果:当细胞膜受到损伤时,其完整性被破坏,通透性增高,对PI的摄入量增加,因此可通过测定PI进入细胞百分率的变化来反映细胞膜通透性的变化。三种剂量的软骨藻酸作用于神经胶质细胞24 h后,用流式细胞仪测定细胞膜的通透性显示,通过细胞膜进入细胞的PI百分率与对照组相比有明显的上升,提示软骨藻酸作用可使细胞膜的通透性显著升高。四、结论软骨藻酸是一种兴奋性神经毒素,这种兴奋性毒性可以引起活性氧(ROS)生成增加,导致氧化应激的发生,HO-1能够因为氧化应激而被诱导,同时氧化应激的发生还可以导致细胞膜功能的损伤。在本研究中,软骨藻酸对神经胶质细胞具有毒性作用,表现为:⑴降低细胞的存活率;⑵使神经胶质细胞脂质过氧化产物MDA的含量显著升高,并抑制其抗氧化酶SOD的活力,对细胞具有明显的氧化损害作用;⑶诱导HO-1蛋白及mRNA的表达增加;⑷抑制神经胶质细胞ATPase的活性;⑸降低细胞膜的流动性;⑹导致细胞膜通透性增高。